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白血病是造血系统的恶性疾病。近几年,研究人员提出,应该从分子角度重新认识白血病,开展针对信号分子激活/抑制的研究,为白血病的防治提供新的思路和方法。白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor, LIF)是一种多功能的、作用广泛的细胞因子,为IL– 6细胞因子家族的一员,能够在体外抑制粒系白血病细胞(如人HL-60、U937、小鼠M1系等)的增殖。然而,由于白血病细胞增长快速并对LIF感应能力很差,机体内有限的LIF无法有效抑制白血病细胞的生长[1]。而外源性、非生理剂量的LIF对脂肪细胞、生殖细胞和内分泌细胞等正常细胞具有显著的细胞毒性,同时干扰了细胞因子间的正常协调作用,所以LIF目前还无法直接用于疾病治疗。进一步研究显示,LIF的生物学效应是通过结合靶细胞膜上的LIF受体(LIFR)来实现的。LIFR包括两个亚基--LIFRα(gp190)和LIFRβ(gp130)。其中,LIFRα含有1239个氨基酸,胞外区由789个氨基酸构成,跨膜区由26个疏水氨基酸组成,胞内区由238个氨基酸构成。LIFRα的胞内区共有三个功能域(Box1、Box2和Box3),其主要作用结构为YXXQ(Y为酪氨酸,X为任意氨基酸,Q为谷氨酰胺),是激活细胞内信号分子的必须序列[2]。本教研室前期工作中已证实,通过脂质体转染的方式,将LIFRα细胞内区全长序列(LIFRα-CT)和含Box3功能域的C末端序列(LIFRα-CT3)分别富集于人类急性早幼粒白血病细胞HL-60胞质中,可促进该系白血病细胞的粒细胞方向分化,并有效抑制其增殖潜力[4-9]。但无论是脂质体还是病毒等转染方式,均只能应用于体外试验,因此,研发可用于体内将LIFRα-CT3安全、高效地导入白血病细胞的方法显得非常有意义。近年研究发现,蛋白质转导结构域(Protein Transduction Domain, PTD)可将全长蛋白质、DNA、化学药物、寡核苷酸、40 nm磁珠和200 nm脂质体等[10]携带入细胞/核。目前最常用的PTD是人类免疫缺陷I型病毒(HIV-1)来源的TAT蛋白片段(TAT-PTD),它具有短小、高效、无毒、快速、不影响下游分子生理功能的优良特性,但常用的原核表达体系得到的融合蛋白因缺乏转录后的剪切、翻译修饰,存在低/无生物活性的可能性[11-14]。因此,要获得有活性的TAT-PTD融合蛋白需用真核表达系统。本课题的目的就是利用真核表达系统制备有活性的LIFRα-CT3融合蛋白,并通过蛋白质转导结构域(PTD)将LIFRα-CT3携带入白血病胞内/核内,观察其对白血病细胞系HL-60的作用,并探讨其机制。为此,我们采用基因重组的方法,将LIFRα-CT3、TAT-PTD、出胞信号肽(Signal Sequence,ss)和融合标签cMyc克隆入真核表达载体pcDNA3.0中,成功构建了pcDNA3.0-ss-TAT-CT3-cMyc重组表达载体和对照载体pcDNA3.0-ss-CT3-cMyc;通过FuGENE 6非脂质体转染法将两种载体分别转染入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中,RT-PCR、免疫印迹和免疫荧光检测显示,TAT-CT3-cMyc可在CHO细胞中转录和表达,表明TAT-CT3-cMyc的真核表达系统已建立成功;进一步利用Realtime-PCR筛选获得了高表达的CHO-TAT-CT3-cMyc细胞系。接着,我们将构建好的CHO-CT3-cMyc和CHO-TAT-CT3-cMyc两个细胞系大量扩增后,更换为无血清培养液,72h后,回收培养液和超声粉碎CHO细胞后的上清, 0.45μm滤器过滤后,利用抗cMyc标签凝胶包被的蛋白层析柱纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳检测显示,纯化获得的目的蛋白正确,且纯度高(大于95%),BCA定量检测得知,共获得732μg的TAT-CT3-cMyc多肽和569μg的CT3-cMyc多肽。最后,将获得的TAT-CT3-cMyc多肽和CT3-cMyc多肽分别按终浓度10μg/ml、30μg/ml和50μg/ml加入到人早幼粒白血病细胞系HL-60的培养基中,观察其对细胞生长和分化的影响,并探索可能涉及的信号转导通路。免疫荧光检测显示,作用时间1h时,TAT-CT3-cMyc多肽组HL-60细胞内可见明显阳性反应,但10μg/ml组荧光强度较弱,30μg/ml组和50μg/ml组可见强阳性反应。灰度分析提示,30μg/ml组和50μg/ml组的荧光强度无明显差别,这表明TAT-CT3-cMyc确可将融合蛋白片段带入HL-60细胞内,并富集于胞核,且作用时间1h,剂量30μg/ml是较理想的条件。免疫荧光检测还证实,TAT融合多肽进行转导时,其阳性率在80%以上,荧光强度在30min~1h内即可达到峰值,此后随时间延长而下降,至8h左右时,荧光强度已非常弱,但仍可检测到。流式细胞术检测显示,30μg/ml TAT-CT3-cMyc多肽作用8h的HL-60细胞,CD14和CD11b的表达在72h时明显增高,表明TAT-CT3-cMyc多肽确有促进HL-60细胞朝成熟粒细胞方向分化的功能。CCK-8细胞增殖检测显示,与野生型和添加了CT3-cMyc多肽的HL-60细胞相比,添加了TAT-CT3-cMyc多肽(30μg/ml,连续暴露4天,每天8h)的HL-60细胞增殖明显下降,表明TAT-CT3-cMyc多肽的连续应用对HL-60细胞的增殖有明显抑制作用。免疫印迹检测显示,在不添加Jak2抑制剂(AG-490)的情况下,TAT-CT3-cMyc多肽组的HL-60细胞中,pSTAT3的水平最高;添加了Jak2抑制剂后,TAT-CT3-cMyc多肽组的HL-60细胞中,pSTAT3分子仍有较清晰的表达,表明TAT-CT3-cMyc组的pSTAT3是由TAT融合多肽在不依赖于Jak2分子的情况下独立激活的。为了证实TAT-CT3-cMyc组HL-60细胞的分化确实是由STAT3分子激活引起的,我们在各组添加了STAT3抑制剂,并再次在蛋白水平检测了CD14/CD11b的表达。结果显示,3组细胞的CD14/CD11b表达量均有一定程度的减低但TAT无差别,表明pSTAT3的表达量与HL-60细胞的分化程度呈正相关。激光共聚焦显微镜观察发现,与野生型和CT3-cMyc多肽组HL-60细胞相比,TAT-CT3-cMyc多肽组HL-60细胞中tSTAT3和荧光pSTAT3的表达明显增强,表明TAT-CT3-cMyc多肽可以促进HL-60细胞内信号分子STAT3的聚集和激活,启动STATs相应的信号转导通路。总之,本研究构建了pcDNA3.0-ss-TAT-CT3-cMyc真核表达载体,首次建立了TAT-CT3-cMyc融合蛋白真核表达系统,纯化获得了高纯度且有生物学活性的TAT-CT3-cMyc融合蛋白,并首次发现,TAT-CT3-cMyc融合蛋白可以在短时间内(<1h)高效进入白血病细胞HL-60内,并通过不依赖Jak2的途径激活STAT3磷酸化,促进急性髓系白血病细胞向成熟细胞方向分化并抑制其增殖。这为进一步利用TAT-CT3-cMyc融合蛋白靶向治疗白血病提供了技术支持和理论依据。关键词:白血病抑制因子,信号转导,STAT3,中国仓鼠卵巢细胞,cMyc标签蛋白,TAT蛋白转导结构功能域小结1、TAT-CT3-cMyc融合蛋白可以高效进入白血病细胞HL-60内,促进急性髓系白血病细胞向成熟细胞方向分化。2、TAT-CT3-cMyc融合蛋白在白血病细胞HL-60内游离存在时,可以以独立于Jak2分子的情况下,激活STAT3磷酸化信号通路,影响其增殖与分化进程。3、通常情况下只能用原核表达系统制备的TAT融合蛋白在本试验中采用真核表达体系CHO也能大量制备,且在额外添加了信号肽序列后可以分泌出胞,纯化后仍有生物学活性。