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随着环境的恶化以及化学产品的使用,植物在生长过程中面临的威胁越来越多。除了生物胁迫外,干旱、洪涝、冷害、热害、盐害、重金属胁迫等非生物胁迫也对植物的生存造成了重大影响。同时,在除草剂和杀虫剂等化工产品的使用过程中,不仅杂草和害虫被毒杀,作物也受到了一定程度的伤害。为了增加作物对胁迫的抗性,降低环境和人为因素对作物生长和产量的影响,本研究主要包含三方面的内容:(1)抗草甘膦基因的筛选和功能验证;(2)水稻EPSPS基因诱变;(3)对大豆SOS1基因的修饰和功能验证。 草甘膦是孟山都公司设计生产的一种广谱除草剂,于十九世纪七十年代开始投入使用。由于草甘膦与磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)结构相似,它能够竞争性结合莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase,EPSPS)上PEP的结合位点,从而导致PEP不能与EPSPS结合,5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate,EPSP)的合成受阻,继而影响到植物芳香族氨基酸的合成,导致植物因缺乏必须的芳香族氨基酸而死亡。为了筛选抗草甘膦的EPSPS基因,我们从不同环境中取了土壤样本进行培养和筛选,得到一个能耐受100mM草甘膦的菌株Enterobacter aerogenes。将该菌株的EPSPS,GOX1和GOX2克隆并在大肠杆菌中表达,用含有不同浓度草甘膦的培养基培养发现,只有转入了EaGOX1基因的大肠杆菌可以在含50mM草甘膦的培养基中生长。这一结果表明,GOX1基因可能是导致Enterobacter aerogenes对草甘膦有耐受性的主要基因,但该菌株能耐受100mM草甘膦可能是EaGOX1与其他基因共同作用的结果。后续研究将检测EaGOX1基因能否提高作物对草甘膦的抗性。 此外,我们还将经过了随机突变的水稻EPSPS基因通过多次硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)诱变或者紫外线(ultraviolet,UV)诱变来筛选抗草甘膦的变异基因。但是最终没能筛选到抗草甘膦的OsEPSPS突变型。 SOS1(Salt Overly Sensitive1)是位于细胞膜上的Na+/H+反向转运体,它是拟南芥维持细胞内低钠状态的一个关键蛋白,其在大豆中是否与抗盐相关,特别是位于SOS1蛋白C-末端的自抑制结构域的改变是否会对大豆抗盐有影响尚不清楚。为了研究这一问题,我们使用目前比较成熟的CRISPR/Cas9体系对大豆中编码SOS1蛋白C-末端的基因序列进行编辑,并筛选出SOS1基因被修饰的植株进行抗盐检测。结果表明,CRISPR/Cas9体系能够对大豆的SOS1基因进行编辑并且这些突变是可遗传的。同时,SOS1蛋白C-末端的改变影响了大豆的抗盐能力,这直接证明了GmSOS1与大豆抗盐性相关。此外,我们的结果也为提高作物抗盐能力提供了一种可选途径。