背景在女性中,乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一,根据分子分型主要分为四型,其中三阴性乳腺癌（Triple Negative Breast Cancer,TNBC）约占20%。TNBC侵袭性更强,预后更差,并且TNBC具有较高的基因组突变率、基因扩增率和缺失率。锌指结构域（Zinc Finger Domains,ZNF）是一种小的蛋白基序可以调节蛋白-蛋白的相互作用。虽然研究表明ZNF蛋白可以直接结合DNA/RNA和调控基因的表达,但一些锌指蛋白可以介导泛素化过程并调节蛋白的稳定性。目的通过分子生物学研究,有望揭示三阴性乳腺癌中ZNF213蛋白（Zinc Figure Protein213）对Hippo信号通路的调节机制,为临床上三阴性乳腺癌的治疗揭示新的机制和药物靶点。方法1、通过q RT-PCR及Western blot检测ZNF213在三阴性乳腺癌细胞系转染的沉默效果及明确ZNF213对Hippo信号通路中靶基因的影响。2、运用细胞划痕实验和trans-well实验,明确ZNF213对三阴性乳腺癌细胞的侵袭及迁移的影响。3、利用荧光素酶报告基因技术检测ZNF213是否影响YAP转录活性。4、通过rescue实验,在沉默掉ZNF213的基础上再沉默YAP,观察Hippo信号通路中靶基因的变化以及三阴性乳腺癌细胞的侵袭及迁移的变化。5、通过查询TCGA、Kmplot数据库及搜集临床样本进行免疫组化,明确ZNF213在三阴性乳腺癌病人的组织中的表达情况。6、通过免疫荧光实验明确ZNF213和YAP的细胞定位,通过免疫共沉淀实验验证ZNF213和YAP是否具有相互作用。为进一步验证ZNF213和YAP的具体结合区域,同时构建了ZNF213和YAP蛋白各自不同结构域的质粒,来检测两者互相结合的具体区域。7、运用Western blot实验技术,通过MG132实验、CHX实验、泛素化实验等实验来验证ZNF213调节YAP蛋白的稳定性和调节方式。结果1、利用三阴性乳腺癌细胞株,通过运用q RT-PCR和Western blot验证ZNF213的沉默效果,并发现沉默ZNF213使Hippo通路中几个经典的靶基因上调非常明显,而当沉默ZNF213可使YAP的蛋白水平明显上调。2、通过细胞划痕实验和trans-well实验,我们发现沉默ZNF213可以促进三阴性乳腺癌细胞的侵袭和迁移,而过表达ZNF213可以抑制三阴性乳腺癌细胞的侵袭和迁移。3、通过荧光素酶报告基因实验来证明沉默ZNF213能够显著促进YAP的转录活性,过表达ZNF213能够显著抑制YAP的转录活性。4、通过rescue实验,在沉默掉ZNF213的基础上再沉默YAP,我们发现沉默ZNF213引起的上调的YAP蛋白水平又下调了,Hippo信号通路中上调的靶基因同样下调,沉默ZNF213加快的三阴性乳腺癌细胞的侵袭和迁移也同样变慢。5、通过TCGA数据库,我们发现ZNF213在三阴性乳腺癌中的表达水平比在正常组织的高,并且ZNF213的表达与YAP靶基因CTGF,CYR61的表达呈负相关。通过Kmplot数据库,我们发现在三阴性乳腺癌中高表达的ZNF213与病人较好预后相关,而高表达的YAP与病人不良预后相关。免疫组化结果显示ZNF213的表达水平与YAP的表达水平呈负相关。6、通过免疫荧光实验,我们发现ZNF213和YAP都主要定位在细胞核中,并且通过Co-IP实验发现ZNF213和YAP具有直接的相互作用,为进一步验证两者的相互作用具体结合部位,通过分别构建两者的结构域,然后通过免疫共沉淀实验验证两者的结合部位分别是在ZNF213的KRAB-A段和YAP的WW段结合。7、通过CHX实验,发现沉默ZNF213可以延长ZNF213的半衰期,而过表达ZNF213可以缩短ZNF213的半衰期。通过MG132实验及Co-IP实验,借助K48、K63等泛素化质粒,进一步证明了ZNF213能够促进YAP的K48连接的多聚泛素化,能够抑制YAP的K63连接的多聚泛素化,最终影响YAP蛋白的稳定。结论在三阴性乳腺癌细胞系中,ZNF213的KRAB-A段和YAP的WW段具有相互作用,进而促进YAP的K48连接的多聚泛素化,从而影响YAP蛋白的稳定性。