【摘 要】
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玉米（Zea mays L.）是重要的粮食作物,除食用、饲用而外,还是淀粉工业的主要原料。根据分子结构可将淀粉分为直链淀粉和支链淀粉两种。全部为支链淀粉的糯玉米食用口感较好,而直链淀粉含量较高的高直链淀粉品种在淀粉工业上的加工价值更高。传统的玉米育种技术虽然已经取得了显著的成就,但在高直链淀粉等品质改良方面进展不在,很难满足农业生产和淀粉工业的需求。以转基因为代表的现代生物技术为玉米品质改良提供了
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玉米（Zea mays L.）是重要的粮食作物,除食用、饲用而外,还是淀粉工业的主要原料。根据分子结构可将淀粉分为直链淀粉和支链淀粉两种。全部为支链淀粉的糯玉米食用口感较好,而直链淀粉含量较高的高直链淀粉品种在淀粉工业上的加工价值更高。传统的玉米育种技术虽然已经取得了显著的成就,但在高直链淀粉等品质改良方面进展不在,很难满足农业生产和淀粉工业的需求。以转基因为代表的现代生物技术为玉米品质改良提供了全新的技术途径。特别是CRISPR/Cas9基因编辑技术,可定向敲除支链淀粉合成的关键基因,创造高直链淀粉品种选育所需的新颖种质。本研究通过sg RNA设计和受体靶点序列验证构建靶向玉米内源淀粉分支酶（Starch branching enzyme,SBE）基因Zm SBE I、Zm SBE IIb和可溶性淀粉合成酶（Soluble starch synthase,SSS）基因Zm SSS III的CRISPR/Cas9载体,农杆菌介导法转化玉米胚性愈伤组织,经抗除草剂筛选、PCR和Southern杂交鉴定、靶序列测定等筛选携带目标突变且不带有选择标记基因的阳性转基因株系,再经田间试验鉴定农艺性状表型后,测定其直链淀粉含量,并在扫描电镜下观察胚乳中淀粉粒的形态和结构,主要结果如下:1.扩增分析受体自交系C01内源Zm SBEI、Zm SBEIIb和Zm SSSIII基因靶点序列,设计单链向导RNA（Single guide RNA,sg RNA）,构建CRISPR/Cas9编辑载体,双酶切鉴定和序列分析表明构建成功。2.用受体自交系C01的未成熟胚诱导胚性愈伤组织,农杆菌介导法转化,经抗除草剂筛选和PCR鉴定,共获得17个T0代植株。经自交繁育、Southern杂交、PCR鉴定和序列分析,筛选出Zm SBEI、Zm SBEIIb和Zm SSSIII基因单突变、Zm SBEI和Zm SBEIIb基因双突变、Zm SBEIIb和Zm SSSIII基因双突变和Zm SBEI、Zm SBEIIb、Zm SSSIII基因三突变且不含选择标记基因Bar的T1代株系各1个。3.除Zm SBEI基因单突变株系而外,其余5个T1代株系的直链淀粉含量均显著高于未转化的受体自交系C01。而且,多数株系的株高和穗位高显著高于未转化受体,百粒重显著小于未转化受体,但穗行数和行粒数基本没有变化。4.扫描电镜观察表明,除Zm SBEI基因单突变而外,其余5个T1代株系的胚乳淀粉粒颗粒较小,排列紧密,且有一些不规则的棒状颗粒,与Zm SBEIIb基因突变的高直链淀粉突变株系相当。5.序列分析表明,Zm SBEIIb基因突变的高直链淀粉突变株系GEMS0067,第9外显子完全缺失,直链淀粉含量高达70%,胚乳淀粉粒颗粒较小,排列紧密,也有一些不规则的棒状颗粒,淀粉糊化温度高,热稳定性强,链长淀粉的比例明显高于野生型对照。6.用验证的sg RNA构建CRISPR/Cas9载体转化获得全部17个转基因事件,Zm SBEI、Zm SBEIIb和Zm SSSIII基因上3个目标靶点的突变效率分别高达49.48%、63.85%和68.75%,这一结果可为相关研究提供参考。综上所述,用CRISPR/Cas9基因编辑技术同时敲除内源淀粉分支酶基因Zm SBE I、Zm SBE IIb和可溶性淀粉合成酶基因Zm SSS III,可创造高直链淀粉玉米种质,与Zm SBEIIb基因突变的高直链淀粉突变株系表型相似,进一步鉴定后可望用于高直链淀粉品质育种。
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