基于核酸等温放大的生物传感检测汞离子研究

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汞离子(Hg2+)是一种剧毒的重金属离子,它可以通过食物链的富集作用的层层累积最终进入到人体内,对人类的肾脏、神经系统等各个器官系统造成不可修复的损伤。汞离子存在于自然界或者人工合成的产品中,如海洋和火山中,化石燃料燃烧排放,金矿的开采,电池制造、电子行业等领域。更重要的是,在牙齿矫正的过程中也存在着汞离子(Hg2+)泄露的可能。因此,一种能够高效快速检测出汞离子的检测方案亟待被发现。基于核酸外切酶Ⅲ的特异性酶切作用,氧化石墨烯的荧光猝灭效应以及T-Hg2+-T的特异性识别,我们开展了以下的工作对汞离子进行检测:(1)基于核酸外切酶Ⅲ辅助的一种高效、高选择、无标记的链置换检测汞离子的方法。带有粘性末端的发夹DNA和具有辅助作用的DNA之间通过Hg2+与两条DNA链段上的胸腺嘧啶(T)之间形成的特殊的错配结构(T-Hg2+-T)引发反应链置换反应进而间接的检测汞离子。嵌入剂染料SYBR Green I(SG)和核酸外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)的使用为实验提供了一种无标记的检测方法同时也降低了背景信号。在本章中对T-T错配的个数、染料SG的浓度、核酸外切酶Ⅲ的浓度、酶切的时间以及温度进行了优化。在所有条件均为最优状态下,汞离子(Hg2+)的线性检测线范围是0.01-1 nM,最低检测限是9.42 pM。此方法展现了良好的选择性,对于实验室的自来水和眼镜湖的湖水都能够很好的检测Hg2+。(2)通过核酸外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)的辅助,嵌入剂SG以及氧化石墨烯(GO)的配合而进行的双级放大杂交链置换反应检测汞离子。首先,辅助DNA与发夹DNA(HP)与汞离子(Hg2+)通过T-Hg2+-T错配结构形成了一条3?端为凹末端的长的双链DNA;加入Exo Ⅲ后,双链DNA从3?端的羟基末端开始被酶切,酶切产物中包含引发杂交链置换反应(HCR)反应的引发链、辅助DNA链段和Hg2+。引发链引发了HCR反应形成一条长的双链DNA结构,并且由于目标的循环使用不断释放引发链,最终实现了对目标的双级放大作用。实验中对辅助DNA链与发夹DNA HP的T-T错配个数、嵌入剂SG、核酸外切酶Ⅲ和GO的浓度以及酶切时间进行了优化。通过优化上述实验条件,在最优的实验的条件下,我们对汞离子进行检测得到的线性浓度在0至1.5 nM之间并且最低检测限为7.37 pM。同时该方法也表现出对其他金属离子良好的选择性,并且对实际样品的检测也具有较高的灵敏度。(3)研究了一种无标记的通过T-Hg2+-T特异性结合机理构建的Y型DNA链段检测汞离子(Hg2+)方法。本实验中在汞离子的存在下,辅助DNA与发夹DNA HP1通过T-Hg2+-T特异性结合进行链置换反应打开HP1的颈环结构形成双链DNA,HP1凸出的末端能够打开发夹DNA HP2,HP3引发第二次的链置换反应,形成Y型DNA链段。加入的核酸外切酶Ⅲ将未反应的发夹DNA HP1、HP2、HP3酶切,降低荧光背景信号,实现了对汞离子的双级放大检测。
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