随着国际能源供应的日趋紧张,节能问题日益为人们所重视。生物沼气以其可再生绿色无污染等优点受到重视,利用农作物秸秆厌氧生产生物沼气是未来能源发展的一个重要方向,既解决能源危机,又充分利用资源、保护环境。而在我国北方地区,低温气候严重制约了沼气发酵的效率。因此,促进低温沼气发酵的研究具有重要的实践意义。本研究利用无菌无氧培养基的限制,从不同生境中筛选、分离耐冷产甲烷菌,通过正交试验对其进行生理生化特性研究,经PCR扩增、16S rDNA测序及同源性分析确定其系统分类学地位,并以外源微生物添加到低温沼气发酵体系中,探索耐冷产甲烷菌纯菌株对低温沼气发酵的影响。研究结果如下：(1)从实验室UASB反应器的污泥中筛选一株耐冷产甲烷菌菌株US-3,该菌株革兰氏染色显阴性,不运动,球状菌。正交试验中各因素对菌株US-3生长能力的影响从大到小依次为底物类型、温度、pH值、Na+浓度,最佳水平分别为底物甲酸钠,温度25℃,pH值6.5,Na+浓度0.6mol·L-1。菌株US-3为梭菌属(Clostridium),相似性为98%。(2)从低温稻田土中分离一株耐冷产甲烷菌菌株DT-6,该菌株革兰氏染色显阴性,不运动,杆状菌。影响该菌株生长能力大小的因素依次为pH值、温度、Na+浓度、底物类型,各因素最佳水平为pH值7.5,温度25℃,Na+浓度为Omol·L-1,底物为甲酸钠。菌株DT-6为柠檬酸杆菌属(Citrobacter),相似性为99%。(3)与空白组相比,1、2、3号三组(分别添加10%、20%、30%的菌株US-3)在15℃条件下均能提高发酵系统的产气量,且添加量越大,产气量越大,3组试验的累积产气量分别为17186m、20704ml、22582ml,分别比对空白组高20.22%、33.78%、39.28%,空白组、1、2、3号四组试验甲烷含量平均值分别为57.32%、59.45%、62.47%、64.07%,添加产甲烷菌株US-3可消耗一定量的有机酸,减小pH值的降低幅度,保持系统的酸碱平衡。同时,提高发酵系统内有机质的利用率,降低COD浓度。(4)4、5、6号(分别添加10%、20%、30%的菌株DT-6)三组试验的累积产气量分别为14212ml、16056ml、17827ml,分别比空白组高3.53%、14.61%、23.09%,三组试验的甲烷含量平均值分别为58.62%、59.94%、61.53%,均高于空白组的57.32%。添加菌株DT-6不同程度的维持发酵系统内的pH值,使发酵反应稳定进行,与空白组相比添加的菌株消耗了一定量的有机质,加速了COD的降解。本课题研究表明耐冷产甲烷菌菌株US-3、DT-6对低温发酵系统均有促进作用,菌株US-3的效果明显好于菌株DT-6。可缓解低温条件对高寒地区沼气发酵的限制,改善我国能源匮乏的现状,具有较好的经济、社会和生态效益。