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本论文基于新鲜莲子极易褐变而导致现有莲子产品模式单一、不易储藏运输、资源浪费的问题,从三个方面深入研究莲子褐变机制,分别是莲子多酚氧化酶(PPO)的结构,莲子中酚类物质的种类、含量和PPO与酚类底物相互作用的过程。通过优化分离与纯化的条件,得到高纯度的莲子PPO进行质谱鉴定,经质谱数据搜库与比对,获知莲子PPO的结构信息;用超声辅助法提取莲子中的酚类物质,经HPLC及Q-TOF LC/MS定性定量分析;将分析所得的酚酸类物质与莲子PPO反应,从颜色变化与反应速率找到特异性酚类底物,通过同源建模构建莲子PPO的三维结构,分子对接软件模拟莲子PPO与特异性底物相互作用的过程。主要研究成果如下:1.以酶活力和酶比活力为指标,对比了提取PPO的四种方法,发现匀浆吸附后丙酮沉淀法提取莲子PPO可获得较高的酶比活力,达289.04±6.25U/mg;采用单因素实验对该提取方法进行优化,得最佳提取参数为:料液比1:5、提取时间2 h、pH=7、含2%PVPP和0.8%TritonX-100提取溶液,优化后PPO粗酶液酶比活力为294.40 U/mg;采用DEAE Sepharose Fast FLow阴离子交换层析、Sephadex G-75凝胶柱层析对粗酶液进行纯化,得到分子量大约为58 kDa莲子PPO,酶比活力为7926.68U/mg,纯化倍数为26.92,回收率为38.48%。2.通过HPLC和Q-TOF LC/MS分析首次测定莲子中14种酚类化合物,分别是:绿原酸、咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、金丝桃苷、芦丁、槲皮素、山奈酚、芹菜素、没食子酸、儿茶素、表儿茶素、芥子酸葡萄糖苷、芹菜素-8-C-戊糖苷-6-C-葡萄糖苷,以HPLC对14种酚类物质进行定量测定,金丝桃苷含量最高,达13.71±0.23 mg/100g,其余含量顺序为绿原酸,p-香豆酸,阿魏酸,槲皮素,芥子酸葡萄糖苷,儿茶素,咖啡酸,芹菜素,芹菜素-8-C-戊糖苷-6-C-葡萄糖苷,山奈酚,表儿茶素,没食子酸。14种酚类的总量为44.91 mg/100g。3.新鲜莲子(2015年6月收获)与-80℃条件下贮藏一年(2014年6月收获)的莲子同时进行4℃保藏试验,发现两者总酚含量变化趋势有较大差异,新鲜莲子的总酚含量,从0天含量为284.61±7.56 mg/100g到12天增至362.78±15.72 mg/100g。而贮藏1年的莲子趋势相反,在0天时为501.08±10.42 mg/100g,5天后递减到419.30±10.32 mg/100g。4.纯化后的莲子PPO经割胶、酶解、色谱、质谱分析后,搜索蛋白质数据库swissprot中睡莲科植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn)数据库,发现莲子PPO与swissprot中睡莲科植物莲序列号为E5L9E4的Polyphenol oxidase(Nelumbo nucifera),匹配度分值为2.03分,序列相似性为3.00,分子量为56.8 kDa。5.将已鉴定的7种酚酸与莲子PPO反应,并进行全波段扫描,得到儿茶素的λmax为425 nm,测得PPO酶活力为1126.00±20.22 U/mL;表儿茶素λmax为430 nm,PPO酶活力为1435.33±65.68 U/mL;没食子酸λmax为385 nm,PPO酶活力为1247.67±23.16 U/mL;而绿原酸在可见光的波长下,并无特征吸收峰,所以在420 nm下测得酶活力为522.00±9.00 U/mL。四种酚酸底物被莲子PPO催化后得到的褐变产物颜色不尽相同,没食子酸的氧化褐变产物颜色最深,肉眼见其与莲子褐变颜色最为接近,但表儿茶素作为底物时,测得酶活力最高,反应颜色为棕色,因此没食子酸和表儿茶素可能是莲子PPO重要的酚类底物。6.利用编号2P3X_A和1BT3_A的蛋白进行同源建模,得到莲子PPO的三维结构,其中有16个α螺旋,5个β折叠,其它都为无规则卷曲,通过预测活性位点,找出莲子PPO的活性中心,再利用Discovery Studio 2.1软件中的CDOCKER模块进行分子对接分别模拟莲子PPO与表儿茶素、没食子酸相互作用过程,发现表儿茶素主要通过氢键、疏水相互作用、范德华力和π-π共轭作用与莲子PPO作用,而没食子酸主要通过氢键、疏水相互作用、范德华力与莲子PPO作用,这些相互作用改变莲子PPO的空间构象,从而使得PPO的空腔适合酚类底物的空间结构,并引起酶促褐变反应的发生。表儿茶素相比没食子酸有着π-π共轭作用和更多的与氨基酸之间的氢键作用,所以对接体系更稳定,结合得更好,更适合作为莲子PPO作用的酚类底物。