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背景与目的ZIC1基因和Survivin基因分别被认为是一个潜在的抑癌基因和促癌基因,并在乳腺恶性肿瘤的发生、发展中起到了重要的作用。本研究旨在进一步确认ZIC1基因在乳腺癌中的作用,分析ZIC1基因与Survivin基因在乳腺癌中的表达水平相关性,并探索与ZIC1基因相关的分子机制。方法(1)收集120例在2014年-2015年间于上海长海医院行乳腺癌根治术的浸润性乳腺癌患者,应用免疫组织化学技术检测乳腺癌组织及对应的癌旁组织中ZIC1蛋白和Survivin蛋白的表达水平,并分析癌组织中两种表达的相关性;(2)选取六种人乳腺癌细胞株(MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-453,SK-BR3,BT-474和BT-549),和一种人正常乳腺上皮细胞株MCF-10A,常规培养后,提取总蛋白,进行western blotting技术检测ZIC1蛋白与Survivin蛋白的表达情况,并筛选合适的乳腺癌细胞株用于后续实验;(3)应用r LV-Zs Green-PGK-Puro和r LV-Zic1-PGK-Puro慢病毒颗粒进行细胞转染,嘌呤霉素筛选细胞后,稳定培养,并应用荧光显微镜及western blotting技术检测ZIC1蛋白转染效率及Survivin蛋白的表达情况;(4)应用MTT法检测稳定转染r LV-Zs Green-PGK-Puro或r LV-Zic1-PGK-Puro慢病毒颗粒的MDA-MB-231和SK-BR3乳腺癌细胞增殖能力;(5)应用平板克隆试验检测转染r LV-Zs Green-PGK-Puro或r LV-Zic1-PGK-Puro慢病毒颗粒的MDA-MB-231和SK-BR3乳腺癌细胞克隆形成能力;(6)应用流式细胞术检测转染r LV-Zs Green-PGK-Puro或r LV-Zic1-PGK-Puro慢病毒颗粒的MDA-MB-231和SK-BR3乳腺癌细胞细胞周期分布情况;(7)应用流式细胞术检测转染r LV-Zs Green-PGK-Puro或r LV-Zic1-PGK-Puro慢病毒颗粒的MDA-MB-231和SK-BR3乳腺癌细胞细胞凋亡情况;(8)利用Minute?Mitochondria Isolation Kit提取转染r LV-Zs Green-PGK-Puro或r LV-Zic1-PGK-Puro慢病毒颗粒的MDA-MB-231和SK-BR3乳腺癌细胞内线粒体及胞浆蛋白;(9)利用JC-1试剂盒检测转染r LV-Zs Green-PGK-Puro或r LV-Zic1-PGK-Puro慢病毒颗粒的MDA-MB-231和SK-BR3乳腺癌细胞的纯化的线粒体膜电位水平;(10)应用western blotting技术检测转染r LV-Zs Green-PGK-Puro或r LV-Zic1-PGK-Puro慢病毒颗粒的MDA-MB-231和SK-BR3乳腺癌细胞内Akt以及线粒体凋亡途径相关蛋白的表达情况;(11)收集稳定转染r LV-Zs Green-PGK-Puro或r LV-Zic1-PGK-Puro慢病毒载体的MDA-MB-231细胞,于裸鼠右侧背部皮下种植成瘤,观察并记录种植肿块的生长变化,于39日后,处死,取组织,包埋,制成组织切片,应用免疫组织化学技术检测ZIC1蛋白及Survivin蛋白的表达情况。结果(1)ZIC1蛋白仅表达在细胞质内,然而Survivin蛋白在胞核内及胞质内均有表达;ZIC1在浸润性乳腺癌组织中的表达明显低于其对应的癌旁正常乳腺组织;而Survivin蛋白在癌组织中的表达明显高于癌旁正常乳腺组织;癌组织中ZIC1蛋白的表达明显低于Survivin,并且两者蛋白表达分数之间存在着明显负相关。(2)乳腺癌细胞株内ZIC1蛋白表达水平均低于乳腺正常上皮细胞,并与Survivin蛋白表达情况相反,稳定转染r LV-Zic1-PGK-Puro慢病毒颗粒后的MDA-MB-231和SK-BR3细胞内,Survivin蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。(3)ZIC1蛋白过表达后,乳腺癌细胞生长被阻滞于G1期,细胞增殖活力、克隆形成能力以及线粒体膜电位水平明显下降,Cyto-C蛋白从线粒体中被释放到胞浆,并且细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。(4)“ZIC1”组种植瘤瘤体体积明显小于“Vector”组,且“ZIC1”组种植瘤瘤体生长速度明显低于“Vector”组;相对于“Vector”组,“ZIC1”组乳腺癌种植瘤瘤体组织中ZIC1蛋白表达水平明显增高,Survivin蛋白表达水平也明显降低。(5)乳腺癌细胞ZIC1蛋白过表达后,Akt,m TOR,P70S6K蛋白的磷酸化水平明显下调,Cyclin D1表达水平明显下降,P21及P27水平明显升高,另外,Bcl-2和Bcl-x L蛋白表达明显降低,Bad磷酸化水平也明显下降,并且Bad蛋白表达水平明显上调,Caspase-9和Caspase-3也受到明显激活作用。结论(1)ZIC1在浸润性乳腺癌组织中的表达明显低于其对应的癌旁正常乳腺组织,而Survivin蛋白与之相反,并且两者之间存在着明显负相关;稳定转染r LV-Zic1-PGK-Puro慢病毒颗粒后的MDA-MB-231和SK-BR3细胞内,Survivin蛋白表达水平明显降低。(2)ZIC1蛋白过表达后,可以通过阻滞乳腺癌细胞生长于G1期来抑制细胞增殖活力及克隆形成的能力。(3)ZIC1蛋白过表达后,乳腺癌细胞内线粒体膜电位水平明显下降,Cyto-C蛋白从线粒体中被释放到胞浆,进而促进乳腺癌细胞发生细胞凋亡。(4)“ZIC1”组种植瘤瘤体生长速度明显低于“Vector”组,且ZIC1蛋白过表达后,能够在瘤体内持续抑制Survivin蛋白的表达。(5)乳腺癌细胞ZIC1蛋白过表达后,Akt/m TOR信号通路的活性受到明显的抑制作用,致使乳腺癌细胞增殖能力明显受到抑制;ZIC1蛋白过表达后,可以调控乳腺癌细胞内Cyclin D1、P21以及P27的表达水平,进而阻滞乳腺癌细胞于G1期内;ZIC1表达升高可以通过线粒体凋亡途径,调控线粒体相关的蛋白表达,降低乳腺癌细胞的线粒体膜电位,并促进乳腺癌细胞发生细胞凋亡的作用。