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研究背景:
骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)是一种分布于细胞外基质中的、含精氨酸.甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp(RGD))三肽序列的分泌型酸性非胶原糖蛋白。这种蛋白最初是从骨基质中分离出来的,广泛存在于各种组织和体液中,包括子宫、胎盘、肾、平滑肌、一些肿瘤组织、白细胞、乳汁、血液。各种不同的免疫细胞,如激活的T细胞和抗原提呈细胞,均可以分泌OPN。OPN的不同分布表明它的功能的多样性。OPN在骨组织矿化、细胞粘附、信号转导、细胞免疫、血管重塑等方面具有多种生物学功能。OPN作为重要的粘附和信号传导分子,它通过RGD基序和CD44受体相互作用,介导细胞间的粘附和信号传导。OPN与CD44结合,能参与巨噬细胞的趋化和粘附及炎症反应的介导。OPN还是一种细胞生存因子,能够保护细胞不发生凋亡。抗OPN的单克隆抗体能促进激活的T细胞发生凋亡。OPN在细胞介导的免疫反应中同样起到重要作用:机体发生炎症反应时,炎症性细胞表达的OPN尚可调节巨噬细胞和单核细胞的功能。
虽然OPN能介导很多生物学功能,但是在移植领域的研究还很少。如果利用抗OPN抗体或者敲除体内的OPN,会不会影响T细胞的作用?OPN作为重要的炎症因子,是否也在小鼠移植排斥反应中发挥作用?这些问题都尚无研究。
凋亡(apoptosis)和坏死(necrosis)是细胞的两种主要死亡方式。细胞凋亡又称程序化死亡,是生物体内普遍存在的生理和病理现象,其特点是细胞主动的、程序化的和耗能的死亡,表现为核固缩、细胞皱缩、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)外翻、凋亡小体形成。凋亡细胞的细胞膜不破裂,不引起炎症反应。坏死是细胞受到各种化学、物理或生物等因素的危害而发生的非程序化的、被动的和破坏性的细胞死亡过程,其表现为细胞能量代谢中止,细胞膜通透性增高。坏死细胞肿胀或破裂,内容物释放到周围组织中,引起炎症反应。
细胞凋亡在维持机体自身耐受中起重要作用。近些年来,凋亡细胞对免疫系统的调节作用受到越来越多的重视。凋亡细胞诱导免疫耐受也已被广泛的实验证明。有研究已经发现体外凋亡细胞可显著抑制T细胞活化,静脉输注供者凋亡细胞可抑制针对供者移植抗原的特异性淋巴细胞增殖;静脉注射供者凋亡细胞可不需要应用免疫抑制剂,明显延长心脏、皮肤和肝脏移植物存活。凋亡细胞诱导免疫耐受主要通过受者的吞噬细胞介导,当细胞发生凋亡时专职递呈细胞,如巨噬细胞或树突状细胞,迅速吞噬凋亡细胞,防止凋亡细胞的胞内容物释放入周围组织。供者凋亡细胞在静脉注射后主要聚集于受者肝脏,并在肝脏局部诱导Th2细胞应答。
因为OPN可以促进激活的T细胞存活,凋亡细胞可以抑制T细胞的活化,所以我们敲除OPN蛋白并研究其能否与凋亡细胞发挥协同作用,使小鼠同种异基因皮肤移植后的排斥反应减弱,并进一步探讨OPN在小鼠同种异基因皮肤移植中的作用。
皮肤移植作为一种操作简单的移植模型,已经被广泛用于移植免疫的研究。在皮肤移植排斥反应中,特异性辅助性T细胞(Th)和细胞毒性T细胞(CTL)被激活。皮肤移植物和宿主之间抗原性差异决定这些特异性Th和CTL细胞的细胞表面表型。皮肤移植排斥反应的早期阶段,主要是供者抗原递呈细胞参与,并介导急性排斥反应;皮肤移植排斥反应的后期阶段,主要是受者抗原递呈细胞参与,并介导慢性排斥反应。我们根据国内外关于皮肤移植的文献报道,按照几种常用的小鼠皮肤移植方法建立自体模型,以自体移植物存活作为判定小鼠皮肤移植技术成功的标准。选择其中移植物存活率最高、操作相对简单的方法制作研究所需的异种移植动物模型。
目的:
1.建立小鼠皮肤移植模型;
2.研究OPN对小鼠皮肤移植排斥反应的影响;
3.研究OPN敲除联合供者凋亡细胞静脉注射对小鼠皮肤移植排斥反应的影响。
方法
1.确定小鼠皮肤移植的方法
移植物为供者的背部、耳部和尾部皮肤。移植床为受者的背部、侧部。移植物和移植床在各种不同的组合下匹配:背部皮肤对背部移植床、背部皮肤对侧部移植床;耳部皮肤对背部移植床、耳部皮肤对侧部移植床;尾部皮肤对背部移植床、尾部皮肤对侧部移植床。
供、受者小鼠麻醉后准备移植皮片和移植床,对合完毕、四角缝合,凡士林纱布和无菌纱布覆盖,医用通气透明胶带固定。移植术后第7天拆除绷带,观察皮片存活情况,判定皮肤移植技术是否成功。
2.通过腹腔注射抗OPN的单克隆抗体23C3,研究OPN对小鼠皮肤移植排斥反应的影响
a)动物分组:受者C57BL/6小鼠,按照体重、年龄和性别相同的情况,随机分为三个大组:未处理对照组6只小鼠;腹腔注射IgG组18只小鼠和腹腔注射抗OPN的单克隆抗体23C3组18只小鼠。其中腹腔注射IgG组根据注射剂量的不同,又分为100μg、200μg和400μg三个小组,每小组有6只小鼠。腹腔注射单抗23C3组根据注射剂量分为100μg、200μg和400μg三个小组,每组有6只小鼠。
b)皮肤移植:取供者小鼠的尾部皮肤,移植至受者小鼠的侧部。四角缝合、固定包扎。皮肤移植后第7天拆除绷带逐日观察皮肤移植皮片存活情况。
c)注射剂量及方法:分别在皮肤移植术的第-1天、第1天、第3天、第5天和第7天腹腔注射IgG和抗OPN的单克隆抗体23C3。小鼠同种异基因皮肤移植术当天为第0天。
d)组织切片:在皮肤移植术后的第8天进行组织切片,观察炎症浸润情况。
3.凋亡细胞的制备
4周龄SPF级Balb/c小鼠,处死后迅速取胸腺研磨,PBS洗涤两次,最终制备成细胞浓度为1×106/ml的单个细胞悬液。用地塞米松20μM诱导6小时。使用Annexin Ⅴ-FITC和PI染色,流式细胞仪检测来判断凋亡率。
4.利用OPN敲除联合供者凋亡细胞静脉输注,进一步研究OPN对小鼠皮肤移植排斥反应的影响
a)动物分组:受者小鼠,按照体重、年龄、性别相同的情况,分为四组:野生型C57BL/6小鼠对照组,6只小鼠; OPN敲除小鼠组,6只小鼠;静脉输注供者凋亡细胞组,6只小鼠;OPN敲除小鼠联合静脉注射供者凋亡细胞组,6只小鼠。
b)凋亡细胞静脉注射:后两组小鼠均尾静脉注射1×108个供者胸腺细胞来源的凋亡细胞。
c)皮肤移植:静脉注射凋亡细胞后的第8天进行小鼠同种异基因皮肤移植术。受者为C57BL/6品系小鼠,供者均为性别和年龄相配的Balb/c品系小鼠。取供者小鼠的尾部皮肤,移植至受者小鼠的侧部。四角缝合、固定包扎。皮肤移植后第7天拆除绷带逐日观察皮肤移植皮片存活情况。
d)组织切片:在皮肤移植后的第8天进行组织切片,观察炎症浸润情况。
5.皮肤移植完全排斥表现:移植皮片发黑、发干、结痂和皱缩等为移植皮片发生排斥反应的表现。判定小鼠皮肤同种异基因排斥反应通常以移植皮片存活面积,或者坏死面积占移植皮片总面积的百分比来定义移植皮片存活还是完全坏死。当小鼠移植皮片有发生排斥反应的表现,而且排斥面积占小鼠移植皮片总面积的百分比>80%,视为完全排斥。
结论
1.在小鼠自体皮肤移植方法中,尾部皮肤移植至侧部移植床的移植术式最利于操作,生存率较高。
2.利用腹腔注射抗OPN的单抗23C3后,不能明显减轻小鼠同种异基因皮肤移植排斥反应。
3.OPN敲除不能明显减轻小鼠同种异基因皮肤移植排斥反应;凋亡细胞输注联合OPN敲除不能使小鼠同种异基因皮肤移植皮片存活时间延长;静脉输注凋亡细胞可能延长小鼠同种异基因皮肤移植物生存时间。
综上,在小鼠同种异基因皮肤移植排斥反应中OPN可能不是关键作用因子。OPN在小鼠同种异基因皮肤移植中的作用需进一步研究。