绵羊肌肉生长抑制素(MSTN)能够负向调控肌肉生长,通过MSTN抗体阻断其功能能够促进肌肉生长。本研究利用已构建绵羊MSTN纳米抗体文库,通过噬菌体展示技术淘选和筛选MSTN纳米抗体基因,构建绵羊MSTN双价纳米抗体,通过小鼠和绵羊实验验证其对肌肉促生长作用和功能,为进一步研发动物促进肌肉生长生物制剂奠定基础。具体结果总结如下:1、噬菌体文库的淘选:对MSTN抗原蛋白进行原核表达和纯化,利用ELISA原理淘选已构建纳米抗体文库,获得1个纳米抗体编码基因,经测序表明与前期筛选结果一致。2、双价绵羊MSTN纳米抗体的表达与纯化:将已获得的绵羊MSTN纳米抗体编码基因通过接头连接为双价纳米抗体基因片段,构建重组原核表达载体在大肠杆菌中诱导表达并纯化,通过SDS-PAGE和Western Blot验证表达蛋白反应原性。大量表达和纯化绵羊MSTN单价纳米抗体与双价纳米抗体蛋白用于动物实验。3、绵羊MSTN纳米抗体小鼠促肌肉生长动物实验:挑选体重均匀的昆明小鼠公鼠随机分组,每组5只,将PBS、BSA蛋白、MSTN蛋白、绵羊MSTN单价纳米抗体、绵羊MSTN双价纳米抗体分别注射小鼠右后肢腿部肌肉,PBS为对照组。每隔两天注射并称重记录小鼠体重变化,取腿部长收肌制作切片,观察肌肉纤维变化情况。结果表明,纳米抗体组小鼠后肢肌肉体积明显超过对照组,纳米抗体组小鼠肌肉占全身比重显著增加,且双价组增重效果优于单价组。肌肉组织学观察(10×10倍镜下,观察相同面积内肌肉纤维数量)表明绵羊MSTN纳米抗体促进单位面积内肌肉纤维数量增加。小鼠促肌肉生长进一步验证:将昆明小鼠公鼠随机分为PBS、单价纳米抗体、双价纳米抗体组,每组10只。注射部位同上,结果表明,双价纳米抗体组肌肉体积与重量显著超过单价纳米抗体组。4、绵羊MSTN纳米抗体绵羊促肌肉生长实验:选取3月龄绵羊9只,随机分为PBS组、单价纳米抗体组、双价纳米抗体组,每组3只,每周右后肢注射2次并称重,每次注射1mg。结果表明,双价纳米抗体组与单价纳米抗体组和PBS对照组增重效果差异不显著。肌肉组织学观察表明,双价纳米抗体组和单价纳米抗体组肌肉纤维数量较PBS组增多,且差异显著。综上所述,本研究成功构建绵羊MSTN双价纳米抗体重组质粒并在大肠杆菌中表达和纯化,动物实验表明绵羊MSTN纳米抗体能够增加小鼠的体重和单位面积肌肉纤维数量,对绵羊单位面积肌肉纤维数量也有促进作用,绵羊MSTN双价纳米抗体促进肌肉生长效果优于单价纳米抗体,双价绵羊MSTN纳米抗体的制备为研发动物肌肉促生长生物制剂提供了候选材料。