犬瘟热（canine distemper,CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）引起的一种高度接触性动物传染病,在世界范围内广泛分布,具有高度传染性、高发病率和死亡率,被我国列为二类动物疫病,已成为危害犬类健康最严重的疫病之一。近年来有报道表明CDV能感染非人类灵长类动物,这也预示着CD具有向人畜共患病发展的可能。目前CD没有有效治疗方法,早期预防和疫苗接种是有效的防控手段。犬瘟热现有的主要检测技术包括:病毒分离与鉴定、免疫学检测技术（ELISA、IFA、GICA）、分子生物检测技术（PCR、LAMP）和基因芯片检测技术。病毒分离与鉴定是诊断犬瘟热的有效技术,但对试验条件和实验人员技术要求较为严苛,不宜作为临床诊断的方法。ELISA具有灵敏度较高,但重复性差、操作复杂只适合血清检测。免疫荧光法（IFA）准确率好,但对检测条件有较高要求,若操作不当易产生非特异性荧光,影响实验结果。胶体金免疫层析法（GICA）操作便捷,但是由于灵敏度有限目前只是被用作犬瘟热的临床辅助检测手段。PCR可通过检测病毒核酸达到检测目的,但所需检测设备价格较高,同时所需检测时间较长。LAMP检测技术具有敏感性高,适用于临床现场检测等优势,但引物设计繁琐,易出现非特异性扩增。基因芯片技术可以对病毒的核酸和蛋白质进行快速的检测,但成本昂贵限制了临床检测的大规模应用。因此探索一种能在临床应用的方便快捷、灵敏度高、特异性强的检测方法对于犬瘟热的预防和控制具有重要意义。目前,犬瘟热的检测技术大多数是以抗原抗体发生免疫反应,由于目前国内生产的CDV抗原抗体产品质量不一,国外进口质量虽有保障,但价格较高。因此制备效价高、特异性强、成本较低的CDV N抗原抗体可为犬瘟热的快速检测提供优良试剂。布拉格光纤光栅（FBG）生物传感器具有耐腐蚀,耐高温,价格便宜,灵敏度高,复用性好,特异性好,无需标记的优点。目前尚未有布拉格光纤光栅生物传感器用于犬瘟热病毒检测的报道,本研究通过对FBG生物传感器进一步进行改进,以提高其检测能力,并应用于犬瘟热病原的检测。本文通过原核表达系统制备犬瘟热病毒核衣壳蛋白（CDV N）,将该蛋白通过长程免疫法腹腔注射BALB/c小鼠,利用PEG法使免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,制备CDV N单克隆抗体。使用氢氟酸（HF）将布拉格光纤光栅的纤芯腐蚀,对光栅表面进行羟基化、硅烷化修饰、涂覆金纳米壳（Au NS）、羧基化、并活化光栅表面羧基基团,将CDV N单克隆抗体通过-NH-CO-共价键结合固定于光纤光栅表面,并利用脱脂奶粉对其进行封闭,搭建了FBG生物传感器检测平台,并对该传感器进行评价,主要包括灵敏度、重复性和特异性分析,并对临床样品进行检测。本文初步建立了基于金纳米壳修饰腐蚀布拉格光纤光栅生物传感器的犬瘟热快速检测技术,为犬瘟热的诊断提供新的检测方法。本文研究内容如下:1.依据Gen Bank网站上发布的CDV N（登录号:DQ522030.1）基因序列,并对其进行分析与优化,使其适合大肠杆菌表达系统,化学合成CDV N全基因,与载体p ET28a（+）连接,构建p ET28a（+）-CDV N重组质粒。将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中进行蛋白表达,对蛋白诱导条件（时间、温度、IPTG浓度）进行筛选,按照最佳诱导条件大量表达CDV N重组蛋白,利用亲和层析镍柱对CDV N重组蛋白进行纯化,利用SDS-PAGE凝胶电泳进行纯度鉴定,用BCA试剂盒进行浓度测定,Western-blot进行特异性鉴定,市售的犬瘟热抗原快速试纸条进行免疫反应性鉴定。2.将制备的CDV N重组蛋白进行充分乳化,对BALB/c小鼠进行腹腔注射,四次免疫后测定血清效价,取经4次长程免疫和1次加强免疫后达到融合标准的小鼠脾脏刮制成细胞悬液,与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）进行融合获得杂交瘤细胞,利用间接ELISA对融合细胞上清进行检测,并对阳性杂交瘤细胞进行两次亚克隆及筛选,得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并进行效价测定。将单克隆细胞株扩大培养,腹腔接种BALB/c小鼠,以诱生腹水单克隆抗体产生。利用protein A柱对腹水进行纯化,使用Sigma亚型鉴定试剂盒检测抗体亚型,对纯化的单克隆抗体进行生物学特性鉴定。3.将布拉格光纤光栅的栅区浸泡于5%的HNO3,去除杂质。使用HF对FBG进行腐蚀,至纤芯直径约为6μm,使用Na OH溶液使光栅表面布满羟基基团（-OH）进行羟基化;接着将光栅浸泡于硅烷偶联剂溶液中通过共价键结合反式,实现表面硅烷化;金纳米壳（Au NS）修饰光栅表面,11-MUA乙醇溶液对光纤光栅进行羧基化,利用EDC/NHS活化剂将光栅表面羧基基团进行活化,将制备的CDV N单克隆抗体与光栅表面结合,完成FBG光栅的修饰,搭建FBG生物传感器平台。分别对不同浓度的CDV N抗原进行灵敏度检测,对同一浓度测定3次进行重复性实验,对不同病毒（禽流感病毒、新城疫病毒、狂犬病病毒、犬瘟热CDV N抗原）进行特异性实验,对几组犬瘟热阳性、阴性临床样品进行临床性实验。结果:1.重组质粒p ET28a（+）-CDV N经过NdeⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定,在1581 bp处出现条带,与预期相符;p ET28a（+）-CDV N/BL21（DE3）工程菌在诱导温度为30℃、IPTG诱导浓度为0.4 mmol/L、诱导时间为8 h时,CDV N重组蛋白表达量最高。重组基因工程菌按照最佳诱导条件进行蛋白的大量表达,并利用亲和层析镍柱进行纯化,SDS-PAGE电泳结果表明CDV N重组蛋白纯度高,达到90%以上;BCA法测得CDV N重组蛋白浓度达1.783 mg/m L;Western blot鉴定结果在60 KD处可见明显的蛋白印迹;犬瘟热抗原快速检测卡可检测出现清晰目的条带,说明CDV N重组蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达,且免疫反应性良好。2.取经4次长程免疫和1次加强免疫并达到融合标准的小鼠脾脏刮制成悬液,与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）进行融合制备杂交瘤细胞,细胞融合率为100%。阳性率为93.8%,经过两轮阳性杂交瘤细胞筛选及两次亚克隆筛选得到6株单克隆细胞株,分别命名为:3-3G,1-10B,3-5A,1-9G,3-8H,5-8E。该细胞株经反复冻存复苏和多次传代,仍能分泌高效价抗体。经单抗亚型鉴定,3-3G与1-10B两株杂交瘤细胞均为Ig G2型,将两株单克隆细胞株进行扩大培养,注射BABL/c小鼠腹腔制备腹水,将腹水通过Protein A柱进行亲和层析纯化。SDS-PAGE凝胶电泳鉴定表明单克隆抗体在25 KD、50 KD有明显条带,且纯度较好,无明显杂带;BCA法测得抗体浓度至少达2.78 mg/m L;通过Western blot鉴定,制备所得CDV N单克隆抗体与纯化的CDV N抗原在预期的60 KD处有蛋白免疫印迹条带,单克隆抗体效价均达到1:2048000。该研究制备的单克隆抗体为后续犬瘟热的检测方法的研究奠定基础。3.搭建了FBG检测平台并建立了犬瘟热检测方法。FBG光纤光栅生物传感器依次经过羟基化、硅烷化、修饰金纳米壳、活化、固定犬瘟热单克隆抗体和脱脂奶粉封闭。随着每一步骤对光纤表面进行修饰,其振幅在逐渐下降,功能化修饰完成其总振幅降低了0.542 d B。涂敷金纳米颗粒后其振幅变化量最大,与前一步相比降低了0.357d B,占整体变化量的69.1%。该生物传感器对CDV N抗原的检测限范围是50 pg/m L～10μg/m L,饱和浓度约为～10μg/m L。通过三次重复试验,其振幅差异结果表明差别较小,重复性好。通过检测禽流感病毒、新城疫病毒、狂犬病病毒、犬瘟热CDV N抗原进行验证传感器特异性,结果显示禽流感病毒、新城疫病毒、狂犬病毒与传感器上的CDV N单克隆抗体不发生免疫反应,而与犬瘟热CDV N抗原反应强烈,说明FBG传感器特异性良好。通过对犬瘟热阳性样品及阴性样品检测,结果显示只有几组阳性临床样本的有较大的振幅强度变化量,说明传感器可满足临床检测要求,临床应用前景较好。结论:本研究成功构建了p ET28a（+）-CDV N/BL21（DE3）基因工程菌,并在原核表达系统中成功高效表达CDV N重组蛋白。以该重组蛋白作为免疫原,长程免疫法进行小鼠免疫,经PEG法细胞融合、亚克隆及筛选,筛选得到6株分泌CDV N单克隆抗体的细胞株。利用制备的CDV N抗原及其单克隆抗体,建立了基于金纳米壳修饰的腐蚀布拉格生物传感器的快速检测犬瘟热病毒的方法,并从灵敏度、重复性、特异性以及临床样品的检测等对该方法进行评价。结果表明,该方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、价格便宜等优点,可用于临床样品CDV的检测,为犬瘟热的早期快速诊断提供了新的检测技术。