背景： 利用干细胞(stem cell，SC)治疗各种组织坏损或退化性疾病是我国“十五”、“十一五”期间的科技主攻方向之一，也是国际上的研究热点，美国《科学》杂志将干细胞研究评为1999年世界十大科学成就之榜首。骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells，MSCs)是干细胞最重要的一种，它具有多项分化的特点，可分化为其他类型组织细胞，且来源相对广泛，不涉及伦理问题，因此MSCs在神经、心脏、肝脏等诸多器官疾病方面的应用潜能受到越来越多的重视。 在肝脏疾病方面，Lee K D等用肝细胞生长因子与致瘤素M通过两步法在体外有效地诱导MSCs向肝细胞分化，4周后，被诱导的细胞在形态和分子标记物上都具有肝细胞特征。Terai等将绿色荧光蛋白标记的骨髓细胞从尾静脉注入到四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化小鼠体内，结果提示：在肝损伤微环境下骨髓细胞可以体内转化成肝细胞。国内北京军区总医院首先将自体骨髓干细胞用于40余例重型肝炎和肝硬化患者的治疗，取得初步的临床疗效。中山三院肝脏疾病研究实验室在“干细胞修复肝脏工程”的系列研究中，自2003年开始，进行了大量正常成人和30余例肝病患者MSCs的培养并对其各项生物学特性进行了深入的研究，并于2005年试探性地在临床对25例晚期肝病志愿者开展经肝动脉途径自体MSCs移植治疗，并取得了明确疗效：患者总胆红素水平在移植治疗4周内下降者达到73.5％，凝血功能在移植治疗4周内好转者达到84.6％。 然而，令人鼓舞地临床、实验结果却缺乏客观的MSCs生长分化证据的支持，MSCs在体内的向肝细胞分化的能力和定居、定位情况尚不十分明确，使植入MSCs在肝脏损伤修复中到底发挥了多大作用难以正确评价。Weissleder于1999年提出分子影像学的概念后，利用分子影像学的方法对移植MSCs进行监测成为研究的热点，本文即是通过多聚赖氨酸(PLL)介导的氧化铁纳米颗粒(SPIO)转染骨髓间充质干细胞(MSCs)，经盲肠静脉移植入肝纤维化大鼠，利用MR成像技术对其进行活体示踪，描述其成像特点，并评价PLL-SPIO对干细胞的标记及活体示踪效果，为进一步研究干细胞活体内增殖、分化提供影像学的支持。 目的： 提取、分离并培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)，探讨SPIO(商品名Resovist，Schering公司)标记MSCs的方法、浓度，比较不同浓度SPIO的转染率及对MSCs的生长、增殖的影响，描述SPIO标记的MSCs体外及活体成像特点，并评价PLL-SPIO对干细胞的标记及活体示踪效果。 方法： 1.分别采用贴壁法和贴壁法+percoll密度离心法获取MSCs，体外传代、培养、纯化并通过流式细胞仪检测CD45、CD29、CD44、CD11b，比较2种方法的优劣。 2.检测获取的：MSCs性能：MTT测定细胞生长曲线，台盼蓝染色检测细胞活力，Hoechst 33258检测凋亡。 3.分别采用铁浓度为25μg/ml及50μ/ml SPIO-PLL标记MSCs，电镜观察细胞内铁颗粒，普鲁士蓝染色显示细胞内铁，分光光度计测量细胞内铁含量；评价2种浓度SPIO-PLL标记MSCs后，对其生长及增殖的影响(MTT、细胞活力、凋亡)。 4.用铁浓度为25μg/ml及50μg/ml的SPIO-PLL标记MSCs,对不同数量级的细胞行MR扫描，扫描序列为：SE序列T1WI，快速自旋回波(FSE)序列T2WI，梯度回波序列(GRE)T2*WI。 5.建立慢性肝纤维化大鼠模型，分为A、B、C三组，分别经盲肠静脉移植标记MSCs(4×106个/2ml)、SPIO2ul(Fe浓度28mg/ml)、未标记MSCs(4×106个/2ml)，并于移植前、移植后1小时、24小时及移植后3、5、7、10、12、15天行MR检查，测量肝脏信噪比(signal-to-noise ratio，SNR)，在信号消失后处死大鼠，取肝脏标本行HE及普鲁士蓝染色。 结果： 1.MSCs接种24h后可见细胞贴壁，先为单个圆形细胞，后伸展为三角形、多角形，并逐渐变成梭形，约7-10天长满培养皿。用贴壁筛选法获得的MSCs接种24h后可见大量的造血干细胞悬浮在培养基中，随着换液及培养时间的延长，造血干细胞被去掉使MSCs得以纯化，而用密度梯度离心法获得的细胞则含有很少的造血干细胞，细胞纯化效果好；流式细胞仪检查表型的结果也显示密度梯度离心法获得的细胞较单纯贴壁法获得的MSCs纯度高。 2.铁浓度25ug/ml细胞内铁含量为10.95±5.13pg/cell，标记MSCs存活率为98.1％±0.04，标记率为97±1％。铁浓度50ug/ml细胞内铁含量为14.22±7.41pg/cell，标记MSCs存活率为97.9％±0.04，标记率为100％。两组间差别无统计学意义，P>0.05。 3.体外MR成像显示：T2*WT序列对标记MSCs的信号变化最敏感，且随着细胞数量级增大，信号变化逐渐明显，显示信号与细胞数量级间存在相关性。 4.标记MSCs组(A组)：与移植前比较，移植后肝脏信号在T1WI、T2WI、T2*WI序列上均明显降低，以T2*WI最明显，此后信号降低程度逐渐减弱，SNR值逐渐升高，至15天与移植前相比，差异无统计学意义(t=3.650,P>0.05)。 注射SPIO组(B组)：移植后肝脏信号亦明显减低，但信号恢复较快，至移植后第3天，SNR值与移植前相比差异无统计学意义(t=2.550，P>0.05)。 未标记MSCs组(C组)：与移植前比较，移植后各时间点SNR值差异无统计学意义(F=0.871，P>0.05)。 标记MSCs组(A组)、注射SPIO组(B组)与未标记MSCs组(C组)比较差异均有统计学意义(t值分别为4.693、2.964，P<0.05)。 注射标记MSCs或SPIO与观察时间之间存在交互作用(F=4.972，P<0.05)：标记MSCs组(A组)与注射SPIO组(B组)之间肝脏SNR随时问变化的差异有统计学意义(F=9.346，P<0.05)。 MSCs移植后肝脏普鲁士蓝染色可见蓝染细胞主要分布在肝小叶间隔，随时问推移，细胞数逐渐减少，但是部分细胞逐渐由肝小叶间隔迁移至肝实质。 结论： 1、贴壁法+密度梯度离心法是骨髓问充质干细胞分离纯化的较好方法，其获得的MSCs较单纯贴壁法纯度明显高。 2、Fe浓度为25ug/ml、50ug/ml的SPIO-PLL标记MSCs，对其分裂、增殖均无影响，标记率分别为97±1％、100％，细胞内铁含量为10.95±5.13pg/cell、14.22±7.41pg/cell，均可满足MSCs磁共振示踪的要求。 3、标记细胞体外成像以T2*WI序列最为敏感，信号与细胞数量级间存在相关性。 4、腹腔注射CCl4和橄榄油混合液(1：5)可以获得满意的大鼠肝纤维化模型，且肝纤维化的程度与注射的时间长度直接相关，有利于控制。 5、盲肠静脉-门静脉途径为MSCs肝脏移植的一条较理想入路，操作简单，出血少，穿刺成功率高，大鼠死亡率低。 6、SPIO-PLL标记MSCs后，利用MR可对其进行短期活体示踪，但是不能满足长期观察的需要。