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人ether-a-go-go目关基因(human ether-a-go-go related gene, HERG)编码心肌延迟整流钾电流快速成分(rapid component of delayed rectifier current,IKr)的α亚基,HERG (或ERG)是抗心律失常药物作用的一个重要靶点,同时也是产生致命性心律失常的重要靶点,人体IKr通道的异常主要以体表心电图QT间期延长(长QT综合征),突发性晕厥和心源性猝死为临床特征。业已表明,基因突变或药物阻断导致的HERG通道功能异常与一种致命性心律失常——长QT综合征密切相关,因此而极大地增加了心源性猝死的风险。见诸文献报道具有延长QT间期的药物种类繁多,包括传统抗心律失常药、抗精神病制剂,一些抗菌素、抗过敏类药物以及抗肿瘤药等。鉴于药物可能存在QT间期延长的潜在危险,在药物研发过程中检测其对HERG的抑制作用成为药物安全性评价的重要指标之一雷公藤红素是第一个从植物雷公藤中分离提纯得到的活性物质,相继有文献报道,雷公藤红素可作用于细胞内多重作用靶点,如NF-κB, Hsp90及其共分子伴侣,蛋白酶体,Akt/mTOR信号通路等发挥其药理学阻断作用,因而具有很高的抗癌、抗炎和抗氧化活性。正是这些显著药理活性,使其成为一种极具药物开发前景的中草药提取物。然而,本课题组前期研究发现,在抗肿瘤抗炎症作用浓度范围内,雷公藤红素可通过激活内质网应激信号通路而诱导原代心肌细胞的凋亡。而在低于这种作用的浓度范围内,雷公藤红素可显著延长心肌细胞动作电位时程,提示其对心肌细胞复极化的显著影响和潜在的致心律失常作用。全细胞膜片钳记录几种与心肌动作电位相关重要离子流的结果显示,雷公藤红素对心肌细胞的去极化过程(INa)没有明显影响,但是明显抑制复极化相关的离子流,包括Ito、IKr、IKI和ICa,其中以对IKr的抑制作用最为显著,提示雷公藤红素通过抑制IKr而导致心肌复极化时程显著延长。YK1101是一种目前尚在研发试验阶段的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi),对原发性皮肤T细胞淋巴瘤有显著抑制作用。为了进一步探讨雷公藤红素抑制IKr的分子机制、观察分析YK1101对心肌复极化重要离子流IKr的影响,本课题分别以大鼠原代心肌细胞和异源表达系统HEK293细胞系为对象,用电生理记录和分子生物学技术观察分析了雷公藤红素和YK1101对IKr电流的影响,并重点探讨了雷公藤红素抑制IKr的分子机制。主要结果如下：(1)全细胞膜片钳记录结果表明,雷公藤红素浓度依赖地抑制在NRVMs记录到的复极化电流IKr。(2) Western blot检测分析发现,在01μM、0.25μM、0.5μM和1.0μM雷公藤红素慢性处理作用下,ERG1a蛋白成熟组分和非成熟组分显著减少,这种抑制作用呈浓度和时间依赖性。将药物处理组相对于对照组蛋白条带灰度分析结果用Hill方程进行拟合,得到雷公藤红素抑制ERG蛋白的量-效曲线。比较分析的结果表明,雷公藤红素对ERG1a蛋白非成熟组分(135kDa)抑制作用的IC50为422.1nM,而对成熟蛋白组分(155kDa)抑制作用的IC50为265.3nM,后者接近其抑制复极化电流IKr的IC50值。这提示,在相对较低浓度的雷公藤红素(<150nM)作用下,主要影响ERG1a蛋白由内质网向细胞质膜的转运过程。而随着雷公藤红素作用浓度的升高,除ERG1a成熟蛋白组分继续受抑制以外,其非成熟蛋白组分的表达也明显受影响。(3) RT-qPCR检测结果显示,雷公藤红素浓度和时间依赖地抑制大鼠心肌细胞ERG mRNA的表达,而对异源表达在HEK293细胞的KCNH2不存在这种抑制作用,提示雷公藤红素对KCNH2基因转录可能存在影响。(4)生物信息学分析结合荧光素酶报告基因以及ChIP检测的结果证明,雷公藤红素对KCNH2基因转录水平存在调控作用,这种作用与其对转录因子NF-κB本身以及NF-κB与KCNH2基因启动子区域的结合有关。在雷公藤红素的影响下,由于NF-κB活性和KCNH2启动子的转录活性显著受抑制,从而导致KCNH2基因mRNA表达受阻,ERG蛋白表达降低,最终在细胞水平上反映为IKr电流密度的降低。上述结果从分子水平揭示了我们前期观察到雷公藤红素影响IKr离子流的一种新机制。(5) YK1101呈浓度依赖性地抑制体外表达的IHERG电流,包括脉冲电流和尾电流,但对IHERG电压依赖性无影响。对通道动力学分析的结果表明,在电压为-10-+10mV时,YK1101加快了HERG通道的失活过程；而在电压为-40～-20mV的范围内,YK1101抑制通道从失活状态恢复的过程。量-效曲线分析显示,YK1101抑制IHERG-tail的IC50为97.40μM,是临床应用该类药物最大血药浓度(约为3.0μM)的32.5倍,提示该药物致QT间期延长的风险较低。综上所述,雷公藤红素和YK1101对IKr电流表现出不同程度的抑制。本研究首次发现,雷公藤红素不仅抑制ERG通道蛋白运输,而且显著抑制该通道mRNA的转录,最终表现为通道蛋白表达的减少和IKr电流密度的降低,而产生这些抑制作用的浓度范围远远低于其抗肿瘤作用的浓度。作为具有很高抗肿瘤活性的药物,在开发雷公藤红素的过程中,其影响心肌复极化、具有延长QT间期的潜在毒性作用不容忽视。