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研究背景:肺纤维化为致命的进行性肺部疾病,它的主要特征表现为成纤维细胞的增殖以及细胞外基质蛋白的沉积,从而破坏肺组织结构,最终导致肺功能丧失。近年来肺纤维化的发病率、病死率都在不断的增高,严重威胁着人们的健康。迄今为止,肺纤维化的发病原因仍不清楚,缺乏有效可靠的治疗方法,因此确定新的治疗手段从而进行有效的治疗已经变得十分紧迫和重要。上皮-间质细胞转化(Epithelial to mesenchymal transition,EMT)在生物体内是一种基本的生理现象,在EMT过程中上皮细胞丧失细胞间紧密连接,失去细胞极性,逐渐获得具有浸润性和迁移性等间质细胞的特性。细胞外基质力学微环境的改变,即硬度和拓扑结构的改变,是肺纤维化的重要特征。尽管许多研究表明上皮间质转化在肺纤维化过程起重要的作用,但力学微环境如何调控EMT过程及具体机理目前尚不清楚。研究目的:从基底硬度和表面拓扑结构两个方面讨论力学微环境对肺泡上皮细胞EMT的影响,并研究PI3K-Akt信号通路在此过程中调控作用,在此基础上揭示力学微环境对EMT相关肺纤维化的调控机制。研究方法:以人肺泡II型上皮细胞A549为研究对象,用聚二甲基硅氧烷作为基底材料,构建不同硬度、不同表面拓扑结构以及硬度和拓扑结构共同作用的三种基底模型。利用SEM观察细胞形态,应用Western Blot、RT-PCR、免疫荧光染色实验从蛋白和mRNA水平检测E-cadherin and Vimentin表达情况,并使用PI3K抑制剂LY294002作用于人肺泡上皮细胞A549,检测p-Akt、VIM以及E-cad表达水平的改变。实验结果:1)不同硬度的PDMS基底不能诱导A549细胞EMT的发生使用PDMS配置不同硬度(10:1、30:1和50:1)的三种基底。经过3天培养,A549细胞在三种基底上的EMT标记基因(E-cadherin、N-cadherin Vimentin)的蛋白水平表达量无统计学意义。2)不同微拓扑结构PDMS基底能够影响EMT过程采用直径分别为4μm、10μm和间距分别为2μm、4μm和7μm,高度为4μm的PDMS微拓扑结构基底培养A549细胞。免疫荧光实验初步证实基底微拓扑结构对人肺泡上皮细胞EMT的影响。与平面PDMS相比,随着微柱直径的增大和间距的减小,E-cad表达下调,VIM表达上调,细胞更容易发生EMT,且微柱间距对EMT的影响更为明显。3)硬度和微拓扑结构相互作用影响EMT过程使用PDMS配置不同硬度(10:1、30:1)的两种微拓扑结构基底。免疫荧光实验证实硬度和表面拓扑结构相互作用对人肺泡上皮细胞EMT的影响。免疫荧光实验证实在较硬基底上,随着微柱间距的减小,E-cad表达下调,VIM表达上调。在较软基底上,随着微柱间距的增大,E-cad表达下调,VIM表达上调。以上结果进一步证实人肺泡上皮细胞的EMT过程受到硬度和微拓扑结构的共调节。4)基底硬度和表面拓扑结构对PI3K/Akt信号通路的影响免疫荧光检测PI3K/Akt通路中p-Akt的表达,用PI3K抑制剂LY294002处理A549细胞后E-cadherin表达上调,p-Akt和Vimentin表达下调。实验结论:1)不同硬度的PDMS基底不能诱导EMT的发生。2)不同表面拓扑结构基底能够影响EMT过程。与平面PDMS相比,微柱直径的增大和间距的减小可以促进细胞EMT的发生,且微柱间距对EMT的影响更为明显。3)硬度和表面拓扑结构相互作用可以诱导EMT的发生。在较硬基底上,随着微柱间距的减小,E-cad表达下调,VIM表达上调。在较软基底上,随着微柱间距的增大,E-cad表达下调,VIM表达上调。4)PI3K/Akt信号通路可能参与硬度-表面拓扑结构诱导的人肺泡上皮细胞EMT的发生。