论文部分内容阅读
宫颈癌是严重威胁女性健康的的恶性疾病,位居女性恶性肿瘤第二。目前使用化学合成药物治疗肿瘤的同时对机体产生毒害作用。因此,寻找安全有效的天然药物成为生物医药领域的一个研究热点。天然抗癌植物性多糖以其毒副作用小、生物活性强和不产生耐药性等优点引起了人们的高度重视。异叶败酱草作为我国传统的中草药,具有清热燥湿、止血、止带的功效,对治疗子宫糜烂、早期宫颈癌等效果显著。本研究旨在评估异叶败酱草多糖级分1 （PHB-P1）抗宫颈癌的作用效果,探讨其作用机制,为开发抗宫颈癌新药提供科学理论依据。试验一,异叶败酱草多糖的分离纯化和活性鉴定。本研究通过水提醇沉法提取了异叶败酱草粗多糖,并经过离子交换柱分离纯化得到分子量均一的异叶败酱草多糖级分1 （PHB-P1）,该多糖级分含有酮糖、葡萄糖糖醛酸等,提取率为1.57%。采用MTT法初步检测PHB-P1对人宫颈癌HeLa细胞和正常人外周血单核淋巴细胞的毒性作用,研究发现PHB-P1对HeLa细胞具有显著的毒性作用,其IC50为52.26μg/mL,而对正常的人外周血单核淋巴细胞没有明显的毒性作用。试验二,异叶败酱草多糖（PHB-P1）抗HeLa细胞增殖机制的研究。本研究作为体外试验以HeLa细胞为研究对象,PHB-P1（50μg/mL）处理HeLa细胞24 h和48 h,通过各种荧光染色法、原位末端标记技术（TUNEL）、DNA片段化分析、细胞周期分析、反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）等技术,检测HeLa细胞的形态和生化特征的变化,以及细胞中caspase-3、明胶酶、端粒酶活性和相关基因表达的变化。研究结果表明PHB-P1（50μg/mL）能诱导HeLa细胞凋亡;能干扰HeLa细胞的细胞周期分布,使细胞在G0/G1期显著增加,伴随G2/M期细胞明显减少;能显著增强了HeLa细胞caspase-3的活性、显著抑制HeLa细胞分泌明胶酶、抑制HeLa细胞端粒酶的活性。而且,PHB-P1（50μg/mL）能够显著上调HeLa细胞中p53、Bax、p14ARF的mRNA表达量,显著下调Bcl-2的mRNA表达量。试验三,异叶败酱草多糖（PHB-P1）对荷瘤小鼠抗氧化力及免疫调节作用的影响。本研究以U14荷瘤小鼠为研究对象,生理盐水处理为阴性对照、环磷酰胺（CTX）为阳性对照药物,连续处理15 d,采用比色法等方法,从PHB-P1影响小鼠机体抗氧化能力和免疫调节方面分析了PHB-P1抗肿瘤的可能机制。研究发现PHB-P1高、低剂量（80、40 mg/kg b.w.）和CTX均能明显减缓肿瘤体积增大而抑制肿瘤生长,能有效地延长U14荷瘤小鼠的生命延长率,生命延长率分别为73.28%、40.46%和54.20%,对肝肾脏没有明显的毒害作用。PHB-P1高、低剂量能显著提高荷瘤小鼠血清中T-AOC活性（P<0.01, P<0.01）和显著降低MDA活性（P<0.05, P<0.05）,还能明显增强SOD活性（P<0.01, P<0.05）。而且,PHB-P1高剂量对肝组织SOD活性有显著的增强效果;PHB-P1高、低剂量均能明显提高荷瘤小鼠肝组织中T-AOC的水平,MDA水平显著减少。同时,PHB-P1高、低剂量处理均能提高荷瘤小鼠肾组织中T-AOC的水平,分别提高了79.65%和59.75%,但对肾组织中的MDA影响效果不明显,只有PHB-P1高剂量提高肾组织中SOD的水平（P<0.05）。PHB-P1高、低剂量（80、40 mg/kg b.w.）灌胃给药后,使荷瘤小鼠的胸腺指数从阴性组的0.79提高到1.37和1.22,脾脏指数而阴性组的11.71提高到13.58和11.88。CTX处理显著抑制小鼠胸腺指数。PHB-P1高、低剂量处理均可以显著提高荷瘤小鼠IFN-γ活性（P<0.01, P<0.05）,分别提高了41.22%和30.22%;高剂量PHB-P1能显著抑制TNF-α的活性（P<0.05）,低剂量PHB-P1的效果不明显;PHB-P1处理也能部分提高IL-2活性,但是效果不明显。试验四,异叶败酱草多糖（PHB-P1）抑制肿瘤生长作用机制的研究。本研究以U14荷瘤小鼠为研究对象,生理盐水处理为阴性对照、CTX为阳性对照药物,连续处理15 d,采用比色法、免疫组织化学技术、流式细胞术等方法,从PHB-P1影响小鼠肿瘤细胞周期和细胞凋亡方面综合分析了PHB-P1抗肿瘤的可能机制。研究结果表明异叶败酱草多糖PHB-P1高、低剂量（80、40mg/kg b.w.）和CTX处理可以有效地抑制U14实体瘤小鼠肿瘤的生长,肿瘤重量抑制率分别达42.68%、31.30%和54.06%,能诱导U14荷瘤小鼠肿瘤细胞发生凋亡,肿瘤细胞凋亡的百分率分别为20.96%、27.85%和31.03%。PHB-P1高、低剂量处理后小鼠血清乳酸脱氢酶（LDH）水平分别下降了23.94%和18.92% （P<0.01、P<0.01）,而PHB-P1高、低剂量处理均未能明显影响碱性磷酸酶（AKP）的水平。研究发现PHB-P1能干扰U14实体瘤小鼠肿瘤的细胞周期分布,使细胞在G0/G1期显著增加,伴随S期细胞明显减少;低剂量PHB-P1可以提高p19ARF蛋白的表达量,但是效果不明显,而高剂量PHB-P1能显著增强p19ARF蛋白的表达水平。而且PHB-P1能显著上调Bax蛋白的表达量,显著下调突变型p53和Bcl-2蛋白的表达量。本研究通过分离纯化得到异叶败酱草多糖PHB-P1,并通过体外培养的HeLa细胞和U14荷瘤小鼠模型试验,研究分析了PHB-P1抗宫颈癌的作用机制和调控途径,为PHB-P1作为天然抗癌药物的进一步研究和临床应用提供理论基础。