灰葡萄孢单羧酸转运蛋白基因BC1G04502.1的功能研究

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灰葡萄孢单羧酸转运蛋白基因已经确认的有6个,分别是BC1G04502.1、BC1G15016.1、BC1G00784.1、BC1G08724.1、BC1G05660.1。本研究首先通过RT-PCR技术确认了灰葡萄孢B05.10中的BC1G04502.1基因具有较高的表达水平。并且通过blast搜索发现该基因与灰葡萄孢另一亚种T4中相关基因具有高度同源性。所以该基因可能是一个高度保守的序列,并具有重要功能。因此本实验选择灰葡萄孢BC1G04502.1基因作为研究方向。因为这是单羧酸转运蛋白家族的继BC1G15016.1基因之后研究的第二个基因。所以称为BC1G04502.1基因首先,实验通过生物信息学的相关方法对灰葡萄孢基因BC1G04502.1编码产物的氨基酸组成、疏水性、信号肽结构、亚细胞定位。产物功能、跨膜区域、二级结构和三级结构进行了预测,并制作了该基因的进化树。后续实验中,又通过Gateway技术构建了BC1G04502.1基因的入门敲除入门质粒PETHG-UP-DOWN,经过LR反应得到基因敲除双元载体pCAMBIA-Bar-△04502敲除突变株,利用根癌农杆菌介导的基因转化的方法,转化野生型灰葡萄孢菌株B05.10得到潮霉素抗性菌株。经分子鉴定之后确认为敲除突变株(△2d-1和△2d-2)和一个异常插入突变株(BC-1)。在后续的基因功能检测的过程中发现BC1G04502.1基因敲除突变株较野生型菌株在PDA平板上生长速率没有差异,但野生型在14d后产生了一些菌核,而突变株则几乎不产生菌核。与野生型相比,敲除突变株在丙酮酸和乙酸的平板上生长缓慢,而在二羧酸上几乎没有体现出来差别。在番茄叶片上的致病性检测结果显示,BC1G04502.1敲除突变株在番茄和苹果上的侵染能力与野生型相比较并没有体现出来差异。这说明了BC1G04502.1基因可能参与丙酮酸和乙酸的转运,以及孢子和菌核的形成,但是对灰葡萄孢的致病性可能并没有影响。
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