背景与目的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是中国南方最常见的头颈肿瘤,放疗是治疗鼻咽癌的首选方法,放疗后鼻咽癌的5年生存率达31%-53%。但由于放疗的区域包括外耳、中耳及内耳,所以听力损失是鼻咽癌放疗后的一个常见并发症,对康复后患者的生存质量造成很大的影响。鼻咽癌患者放疗时耳蜗接受的放疗剂量可达96%,因此放疗在杀伤肿瘤细胞的同时,势必损伤正常组织而产生副作用。感音神经性耳聋为放疗后常见的并发症,放射性内耳损伤引起的感音神经性耳聋主要表现为渐进性听力下降,听力损失以高频为主,甚至会出现全聋。目前放射后耳蜗的损伤已得到公认,但是由于放疗剂量、放射时间、放射源及观察对象不同,针对放疗后出现感音神经性耳聋的临界放疗剂量国内外还没有统一的标准。对于放射后耳蜗以上的听力通路受到何种程度的影响,国内外在这方面的研究相对较少。目前临床上耳蜗功能的监测多采用畸变产物耳声发射(distortion product otoacoustic emission, DPOAE),耳蜗以上听觉通路的监测多采用听性脑干反应(auditory brainstem response, ABR),二者的结合更有助于判断听觉神经通路的功能和完整性。本实验通过对小鼠进行DPOAE和ABR的监测,进一步探讨不同放射剂量及时间的放射线照射后小鼠耳蜗及其以上听觉神经通路损伤改变特点,为临床制定合理的放疗剂量及探讨放射性内耳损伤的机制提供更多的实验依据。早在1970年已经有学者观察到放射线照射后内耳结构会出现不同程度的改变。由于人体病理标本难以采集,因而有关放疗后耳蜗形态学改变的研究大部分是以实验动物为研究对象的,但同时由于研究时所施加的放疗剂量及观察时间不同,因此所得结果各异。本实验研究将进一步探讨放射线照射后小鼠耳蜗形态学的改变,通过观察单次不同放射剂量及时间对Balb/c小鼠耳蜗显微和超微结构的影响,探讨放射线所致感音神经性耳聋机制的形态学依据。鼻咽癌患者放疗后感音神经性耳聋的发生机制目前仍然不清楚,通过大量的实验研究目前认为,辐射对组织细胞的脂质过氧化作用产生的一系列自由基反应以及微小血管循环障碍是造成放射性内耳损伤的机制。Prestin蛋白是耳蜗外毛细胞的动力蛋白,近来国内有学者通过实验研究发现放疗晚期所致感音神经性耳聋机制可能与耳蜗外毛细胞Prestin蛋白的表达相关。本实验将在观察Prestin蛋白在外毛细胞分布特征的基础上,重点研究放疗早期耳蜗外毛细胞Prestin蛋白表达变化特点,探讨外毛细胞Prestin蛋白的表达是否与放疗后出现的高频感音神经性耳聋具有相关性和放射性内耳损伤的机制,为防治鼻咽癌放疗后引起的感音神经性耳聋的发生提供依据。方法1、入组标准：Balb/c小鼠,雄性,年龄为4周；无外耳畸形；电耳镜检查无外耳道感染流脓、鼓膜完整；ABR检查给予声刺激强度为click lOdBnHL双耳均能引出Ⅰ-Ⅳ波,且各波幅及峰潜伏期大致正常。DPOAE检查给予L1/L2=80/80刺激强度双耳均通过。2、放射模型的制备：小鼠称重,2%戊巴比妥钠溶液按0.3ml/l00g的剂量行腹腔注射麻醉后,俯卧位固定,在X线下定位,确定内耳照射区域。然后于相同体位固定在直线加速器治疗床上。美国Varian2100直线加速器6MeV电子线,剂量率为400cGy/min,源皮距100cm,用铅档块避免呼吸道、消化道受照。参考深度为皮下1.5cm,对实验组分别给予小鼠右耳内耳单次8Gy、12Gy、16Gy的吸收剂量,放射线照射后第3、7天对各项待测指标进行检测。3、听力学研究：选取70只健康的Balb/c小鼠随机分成4组,对照组和3个实验组,实验组分别给予一次性8、12、16Gy放射线剂量的照射,每个实验组随机分成2个小组,分别在照射前和照射后第3、7天对小鼠行DPOAE及ABR检测。4、形态学研究：选取16只健康的Balb/c小鼠随机分成4组,对照组和3个实验组,实验组分别给予8、12、16Gy放射剂量的放射线照射,在照射后第3、7天处死小鼠,取耳蜗标本后行石蜡包埋、组织切片及HE染色,每组取耳蜗标本行扫描电镜观察。5、分子生物学研究：选取70只健康的Balb/c小鼠随机分组,对照组和3个实验组,3个实验组分别接受8、12、16Gy放射剂量的放射线照射,每个实验组随机分成2个小组分别在照射后第3、7天处死放射组小鼠,取耳蜗标本后行石蜡包埋、组织切片及免疫组织化学实验,光学显微镜下观察外毛细胞Prestin蛋白表达分布定位,然后使用分析测量图像软件(Imageproplus, IPP)定量分析外毛细胞Prestin阳性表达浓度值。6、统计学处理：实验结果均采用SPSS13.0统计软件进行方差分析,取P<0.05为差异有统计学意义。结果1、实验组小鼠分别接受8、12、16Gy照射剂量后第3天DPOAE幅值与对照组比较无明显改变(P>0.05)；照射后第7天不同照射剂量组小鼠8、10、12kHz的DPOAE幅值均较正常对照组小鼠显著降低(P<0.05)；正常对照组与各照射组小鼠的DPOAE幅值随着剂量的增加依次逐渐降低,在8、10和12kHz有统计学意义(P<0.05),在4、6kHz无统计学意义(P>0.05)。分别给予小鼠8、12、16Gy放射剂量后行ABR检测发现照射后第3天反应阂出现短暂的提高,照射后第7天反应阈恢复正常,呈波动性改变,照射第3天反应阈的改变与对照组比较有统计学意义；Ⅰ、Ⅱ潜伏期在照射后第3天较正常对照组时间显著延长(P<0.05),在照射后第7天潜伏期恢复正常,与对照组比较没有明显改变(P>0.05)。2、扫描电镜观察发现,正常组内毛细胞及外毛细胞排列整齐,无倒伏、紊乱及缺失；各放射组内毛细胞出现轻微倒伏及排列紊乱,外毛细胞偶有缺失。HE染色结果示各放射组耳蜗内毛细胞、外毛细胞、血管纹细胞及支持细胞在放射后第3、7天较对照组未出现明显病理形态学异常。3、外毛细胞Prestin蛋白阳性表达部位主要位于细胞核以上的侧膜上；细胞核以上的细胞质也有表达,但表达较弱。定量分析显示实验组放射后第3、7天耳蜗底回外毛细胞Prestin蛋白表达与对照组比较无明显改变,耳蜗顶回外毛细胞Prestin蛋白表达上调。结论1、此研究发现放射线一次性照射后第7天可导致小鼠高频听功能出现损伤,但是耳蜗以上的听觉神经通路可能是短暂的可逆性功能障碍。关于放射治疗后耳蜗以上的听觉神经通路何时出现改变以及可以耐受的放疗剂量也有待于进一步的实验研究。通过了解放疗后内耳损伤出现的时间及临界耐受剂量有望找到一种可靠的客观的预测指标,用以制定合理的放疗方案,尽量减少放疗后感音神经性聋的发生,提高患者的生存质量。2、在一次给予等于或低于16Gy放射剂量照射后早期耳蜗形态学仅有轻微改变。此研究的结果表明,放射线照射后早期的耳蜗形态学结构变化并不明显,但是随着照射剂量及时间的增加耳蜗形态结构的损伤逐渐加重,且以底回病变重于顶回。这些结果为放射性听觉损伤常以高频听力为主的临床特征提供了形态学的实验证据,也提示耳蜗的听觉功能对电离辐射的作用是敏感的,而且有可能早于形态学的改变,并表现出明显的量-效和时-效的正相关系。本研究的结果为头颈部肿瘤患者放疗后出现感音神经性聋的机制研究提供了动物实验的形态学依据。3、在此实验研究中得出Balb/c小鼠耳蜗外毛细胞Prestin蛋白的表达部位主要在细胞核以上的侧膜上；放射性内耳损伤机制可能与Prestin蛋白相关。Prestin蛋白是耳蜗外毛细胞的动力蛋白,它能感受细胞膜电位的变化,引发外毛细胞的形状和表面积的改变,能驱动耳蜗外毛细胞的电能动性(electromotility),产生耳蜗的放大器作用,因而使哺乳动物的听觉具有高度的敏感性、广阔的听觉域和敏锐的频率选择性。综合相关文献及本研究结果分析发现,Prestin蛋白可能在放射性内耳损伤机制中起到了一部分作用,是否有其他的分子基础参与放射性内耳损伤,需要进行多方面和长期观察研究。鼻咽癌患者放疗后出现内耳损伤,严重降低了鼻咽癌患者放疗后的生活质量,目前根据放疗后内耳损伤的可能机制,经过中耳等局部给予抗氧化剂和抑制细胞凋亡的药物对治疗放疗后内耳损伤的有一定的疗效,但是疗效依然不肯定。因此需要进一步实验研究放射性内耳损伤的分子生物学机制,从而寻找更好的方法来防治放疗后出现的耳聋并发症,从而提高鼻咽癌放疗患者的生存质量。