论文部分内容阅读
光合作用是地球上最重要的生化反应，为生物界的几乎所有生物提供生命活动所需的能量。叶绿素则是光合作用中最重要的色素分子，它的合成离不开镁螯合酶的参与。镁螯合酶是一个异源三聚体复合物，在植物中它由Ⅰ(CHLI)、D(CHLD)和H(CHLH)三个亚单位组成。这些亚单位的功能非常重要和保守，任意一个亚单位发生突变都有可能造成植株失绿表型。 在本研究中我们分离到一个大豆叶片半显性失绿突变体y，植株绿色:浅绿色:黄色分离比大致接近1∶2∶1。图位克隆的结果表明控制该性状的基因可能是一个编码Ⅰ亚单位的CHLI旁系同源基因，这里我们命名为GmCHLI1。除了GmCHLI1可能控制y突变体的性状外，我们还发现GmCHLI1的重复基因GmCHLI2是控制y9突变体叶片失绿性状（浅绿色）的候选基因。在大部分植物中，Ⅰ亚单位通常由一个或两个基因编码而成。但是在大豆中除了GmCHLI1和GmCHLI2外，还存在另外两个CHLI旁系同源基因GmCHLI3和GmCHLI4。GmCHLI3和GmCHLI4也是一对重复基因。基因重复有利于基因的进化，导致基因产生新功能化、亚功能化或者去功能化。这使得大豆中Ⅰ亚单位的编码情况相比其它植物来说更加复杂。因此，确定哪个旁系同源基因是编码Ⅰ亚单位的主要功能基因以及它们相互之间是怎样协同作用的就变得十分必要。 对GmCHLIs的表达模式进行分析，结果发现除GmCHLI4外其它三个GmCHLIs均在叶片中高表达。四个GmCHLIs均受到昼夜节律（16h光照/8 h黑暗）的调控，在接受光照8小时或12小时后表达量最高。另外，我们还发现GmCHLI1和GmCHLI2的表达量要明显高于GmCHLI3和GmCHLI4的表达量。与野生型大豆相比，四个GmCHLIs的表达量在纯合的y突变体单叶中均明显下调，在杂合的y突变体和y9突变体单叶中则稍有下降或者没有明显变化。这暗示GmCHLIs表达量的降低可能是纯合y突变体的失绿表型加重的一个重要原因。 拟南芥转基因实验结果表明，四个GmCHLIs基因均能恢复拟南芥同源基因chlil突变体(cs215)的失绿表型，并且互补的强弱与转基因的表达量高低呈正相关。与之相反，突变的GmCHLI1(mGmCHLI1)和GmCHLI2（mGmCHLI2）不但不能恢复cs215突变体的失绿表型，反而会加重转基因拟南芥的失绿表型，并且mGmCHLI1和mGmCHLI2表达量越高，失绿表型越严重。 为了揭示四个GmCHLIs协同调控叶绿素生物合成的分子机制，我们做了GmCHLIs与自身，以及与大豆镁螯合酶其它两个亚单位D(GmCHLDs)和H(GmCHLHs)之间点对点的酵母双杂交实验和双分子荧光互补实验。蛋白互作的结果表明，所有的GmCHLIs、GmCHLDs、GmCHLHs组合之间均能相互作用。另外，mGmCHLI1或mGmCHLI2仍能参与这些蛋白之间的互作，并且mGmCHLI1与GmCHLI2（或mGmCHLI2与GmCHLI1）之间的互作能力要强于GmCHLI1与GmCHLI2之间的互作能力。 此外，y突变体的代谢组和转录组结果暗示大豆种子中异黄酮的生物合成与镁螯合酶的活性可能存在紧密的共相关性。 综上所述，我们认为GmCHLI1与GmCHLI2是编码Ⅰ亚单位的主要功能基因。突变的mGmCHLI1与mGmCHLI2可能通过与正常的GmCHLIs竞争，从而组装成功能异常的GmCHLIs蛋白多聚体，进而抑制镁螯合酶的活性。