目的：　　1.分离NaKuI1全长cDNA序列，并进行生物信息学分析　　2.构建重组表达载体pET32a-sumo/NaKuI1，分离纯化目的蛋白rNaKuI1　　3.检测rNaKuI1对丝氨酸蛋白酶的抑制作用　　4.初步鉴定rNaKuI1体外抗纤溶活性　　方法：　　1.分离NaKuI1全长cDNA序列，并进行生物信息学分析　　根据预测的不完整美洲钩虫 Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因序列（GenBank No. XM_013449790）设计引物，运用SMART-RACE技术分别从美洲钩虫成虫cDNA中分离NaKuI1 cDNA的5’和3’末端序列，将获得的3’及5’末端完整序列用软件DNAstar进行比对拼接，获得cDNA全长序列。利用各在线生物信息学软件分析预测NaKuI1的信号肽、理化性质、二级结构、三维构象，并在Genbank数据库中搜索相似氨基酸序列。　　2.原核表达与分离纯化重组蛋白rNaKuI1　　从美洲钩虫cDNA中扩增NaKuI1成熟肽编码序列，与预期大小相符的扩增产物经纯化后，用BamH I和Hind III进行双酶切，回收酶切产物，与经同样双酶切的质粒pET32a-sumo用T4DNA连接酶进行连接。连接产物转入E. coli BL21（DE3）后过夜培养，经菌落PCR及测序鉴定，鉴定正确的重组质粒则命名为pET32a-sumo/NaKuI1。用IPTG诱导融合蛋白表达，离心收集菌体。菌体经溶菌酶和超声破碎，高速离心后收集沉淀。沉淀中的包涵体用Inclusion Body Protein Extraction Kit方法溶解、透析复性获得可溶性的融合蛋白，再用Ni-NTA亲和层析纯化、并用SUMO蛋白酶切割融合伴侣后获得rNaKuI1。　　3.检测rNaKuI1对丝氨酸蛋白酶的抑制作用　　用发色底物法检测其对人纤溶酶、人胰蛋白酶、猪胰蛋白酶、牛α-胰糜蛋白酶、人中性粒细胞弹性蛋白酶、人组织蛋白酶G、人蛋白酶3和猪胰弹性蛋白酶的抑制情况，并用Graphpad Prism5计算抑制常数（Ki）值。　　4.初步鉴定rNaKuI1体外抗纤溶活性　　用纤维蛋白平板法测定 rNaKuI1对人纤溶酶溶解纤维蛋白的抑制作用。SDS-PAGE电泳观察rNaKuI1对人纤溶酶溶解纤维蛋白原的抑制作用。　　结果：　　1.成功分离到NaKuI1全长cDNA序列，生物信息学分析表明其最大阅读框编码84个氨基酸残基组成的多肽，其中含16个氨基酸残基组成的信号肽，68个氨基酸残基组成的成熟肽，预测其分子量为7822.88 Da。成熟肽二级结构包括57.35%的α-螺旋、7.35%的β-折叠、10.29%延伸带、25%无规则卷曲，其氨基酸序列与多种Kunitz/BPTI结构域蛋白相似，最高达76%（Genbank KIH59175.1）。　　2.成功获得了NaKuI1成熟肽编码序列，连接成熟编码序列与表达载体pET32a-sumo，获得重组表达质粒，并将此重组质粒转入E. coli BL21(DE3)中，成功构建pET32a-sumo/NaKuI1原核表达系统。成熟肽原核表达产物为包涵体，包涵体经变性、复性、Ni-NTA纯化、酶切获得纯化后的rNaKuI1。　　3. rNaKuI1无抗凝活性。在100倍摩尔浓度比下，rNaKuI1能抑制近100%的人纤溶酶（5 nmol/L）、人胰蛋白酶（1 nmol/L）和猪胰蛋白酶（5 nmol/L）活性，约31.45%的牛α-胰糜蛋白酶（1 nmol/L）活性和25.18%的人中性粒细胞弹性蛋白酶（5 nmol/L）活性，而对人组织蛋白酶G、蛋白酶3和猪胰弹性蛋白酶均无抑制作用。rNaKuI1抑制猪胰蛋白酶、人胰蛋白酶及纤溶酶的Ki值分别为（14.49±3.97）nmol/L、（21.17±7.22）nmol/L和（21.72±3.95）nmol/L。　　4.在纤维蛋白平板试验中，3000nmol/L的rNaKuI1可将近完全抑制终浓度为500nmol/L的人纤溶酶溶解纤维蛋白的作用。SDS-PAGE电泳图显示，800nmol/L rNaKuI1可完全抑制200nmol/L人纤溶酶降解纤维蛋白原的作用。　　结论：　　本研究首先从美洲钩虫成虫cDNA中获得了NaKuI1全长cDNA序列。通过构建原核表达系统，分离纯化获取重组多肽rNaKuI1，体外明确了其具有较强抑制胰蛋白酶和纤溶酶活性的特性，可能在虫体抵抗宿主胰蛋白酶损伤及炎症反应中发挥一定作用，有利于虫体生存及摄取营养。