第一部分磁共振波谱成像对人脑胶质瘤侵袭性的应用研究目的:脑胶质瘤是脑内最常见的原发性肿瘤,绝大多数胶质瘤为侵袭性生长,表现为恶性特征。关于胶质瘤的侵袭性的影像学评价一直是关注的重点。磁共振波谱成像作为非侵入性检查技术,可以获得活体脑组织的生理及病理的代谢产物信息。通过这些代谢产物的变化可以对胶质瘤疾病进行定性诊断及判定随后的治疗效果,磁共振波谱成像中1H-MRS因为其应用的广度和成熟度,逐渐成为对胶质瘤进行评价的重要手段。1H-MRS结合传统MRI技术可以提高脑胶质瘤术前诊断和病理分级的准确性,反映脑胶质瘤的生化物质代谢特性,从而使临床选择最合理的治疗方案。本研究主要的研究目的是通过对各病理级别脑胶质瘤病灶及瘤周组织1H-MRS特点进行分析,探讨1H-MRS对于脑胶质瘤侵袭性的评价作用。方法:在临床选行手术治疗并病理证实的胶质瘤患者54例,其中男性32例,女性22例。年龄范围为20-77岁,平均年龄为46岁。选取志愿者30名作为对照组,年龄为18-64岁,平均年龄为43岁。两名副主任及以上级别的病理科医生采用双盲法对患者的病理切片进行诊断,根据W HO2016年标准的对胶质瘤的分级进行组别划分,低级别组(包括WHOⅠ、Ⅱ级),高级别组(包括WHOⅢ、Ⅳ级),其中低级别组24例,高级别组30例。另外两名副主任及以上级别的影像科医生采用双盲法对患者的常规颅脑MR及增强MR图像进行分析,依据以下标准进行分组:非水肿组,(常规MR检查及增强MR检查病变范围无明显变化),此组共18例;水肿组(增强MR检查病变范围明显小于常规MR检查),此组共36例。对上述各组患者及志愿者进行颅脑常规MRI、增强MRI扫描及增强扫描48小时后的1H-MRS扫描。进行1H-MRS扫描时胶质瘤患者利用T2WI图像进行感兴趣区(ROI)的选取,ROI位于病灶在轴位T2WI图像上显示的最大层面,应该尽量包括胶质瘤瘤体、瘤体周围水肿带、瘤体周围无水肿区。应该尽量避开空气、骨骼及脂肪组织。瘤体周围RO I范围为瘤体周围2-15mm。志愿者ROI区选择在侧脑室上方半卵圆中心区域,包括双侧额叶及顶叶的脑白质。采用press进行roi区成像。扫描完成后将图像导入西门子syngomr图像工作站进行处理,在代谢解剖图像选择体素,计算出各roi代谢物naa、cho、cr波谱波峰的峰下面积和cho/cr、naa/cr、和cho/naa比值。通过统计分析软件分析比较各组间1h-mrs代谢产物的比值来判断1h-mrs对脑胶质瘤侵袭性的评价。结果:高低级别组瘤体区代谢产物比值与对照组正常脑组织代谢产物比值具有差异,差异具有统计学意义,具体差异为cho/cr、cho/naa明显升高,naa/cr降低;高级别组于低级别组瘤体代谢产物各比值比较,高级别组cho/cr、cho/naa值高于低级别组,naa/cr值低于低级别组,差异具有统计学意义。高低级别组瘤周组织代谢产物比值与对照组正常脑组织代谢产物比值有差异,差异具有统计学意义,具体差异为cho/cr、cho/naa明显升高,naa/cr降低;高级别组于低级别组瘤周组织代谢产物各比值比较,高级别组cho/cr、cho/naa值高于低级别组,差异具有统计学意义,naa/cr值低于低级别组,差异无统计学意义。水肿组瘤体区与对照组正常脑组织代谢产物比值比较具有差异,差异具有统计学意义,具体差异为,cho/cr、cho/naa明显升高,naa/cr降低;非水肿组瘤体区与对照组正常脑组织代谢产物比值比较,cho/naa升高,naa/cr降低,cho/cr比值升高,差异有统计学意义,水肿组与非水肿组瘤体区代谢产物比值比较,cho/naa,naa/cr,cho/cr差异无统计学意义。水肿组瘤周组织与对照组正常脑组织代谢产物比值有差异,差异具有统计学意义,具体差异为cho/cr、cho/naa升高,naa/cr降低;非水肿组瘤周区与对照组正常脑组织代谢产物比值比较,cho/naa升高,naa/cr降低,差异具有统计学意义,cho/cr差异无统计学意义。水肿组与非水肿组组瘤周组织代谢产物各比值比较,cho/naa升高,差异具有统计学意义,naa/cr和cho/cr差异无统计学意义。结论:1h-mrs可以对胶质瘤的代谢特点进行分析,对不同级别的胶质瘤对周围组织的侵袭性作出评价。1h-mrs对颅脑常规mri判断胶质瘤周围水肿区的侵袭性作出补充证明并且能对对不出现瘤周水肿的胶质瘤的瘤周组织的侵袭性提供新的评价手段。第二部分β-catenin与fra-1相关蛋白在人脑胶质瘤的表达及其与1h-mrs波谱的相关性研究目的:在分子水平上,胶质瘤的侵袭性受到多种细胞因子的调控,这其中wnt/β-catenin信号通路及原癌基因fra-1在胶质瘤发生发展中起到关键的作用。然而目前为止对于wnt/β-catenin信号通路中重要因子的β-catenin及fra-1在胶质瘤中的表达及作用机制研究较少,对于其与评价胶质瘤侵袭性重要手段的1h-mrs波谱的关系研究更少。本研究旨在通过人脑胶质瘤中β-catenin及fra-1相关蛋白这两种与侵袭性相关的因子的表达进行测定,判断β-catenin及fra-1相关蛋白在不同级别人脑胶质瘤中的表达水平是否存在差异,从而确定其对胶质瘤侵袭性的促进作用;并对胶质瘤中β-catenin及fra-1相关蛋白的免疫组化结果与1h-mrs代谢产物水平进行相关性研究,以期望在分子水平找到1h-mrs评价胶质瘤侵袭能力的理论依据。方法:选取2014-2015年于河北医科大学第三医院行手术治疗并病理证实的胶质瘤患者87例,其中男性51例,女性36例。年龄范围为20-77岁,平均年龄为46岁。患者在知情同意情况下进行检查。另外选取颅脑外伤内减压需切除脑实质组织患者15例,作为免疫组化的对照组。两名副主任及以上级别的病理科医生采用双盲法对患者的病理切片进行诊断,根据who2016年标准对胶质瘤的分级进行组别划分,低级别组(包括whoⅠ、Ⅱ级),高级别组(包括whoⅢ、Ⅳ级),其中低级别组43例,高级别组44例.对胶质瘤患者行常规mr及颅脑1h-mrs扫描,将图像导入西门子syngomr图像工作站进行处理,roi选取瘤体区(尽量选取瘤体实质,避开坏液化坏死区域),计算cho/cr、naa/cr、和cho/naa比值。上述患者胶质瘤瘤体区及颅脑外伤减压患者的正常脑组织进行免疫组化分析,取材时应以胶质瘤患者术前常规mri及1h-mrs图像结果,与临床手术医师进行讨论取材位置。免疫组化主要针对胶质瘤及正常脑组织内β-catenin及fra-1的表达情况进行分析。免疫组化结果采取两名病理科医生双盲法计算胶质瘤β-catenin及fra-1的增殖指数并参照fromowitz标准进行评分:免疫组化结果评分=染色强度评分×阳性细胞百分率评分,评分在0-6分定义低表达,7-12分定义为高表达。应用统计学软件对对正常组、低级别组及高级别组胶质瘤中β-catenin及fra-1的表达情况进行分析,对β-catenin及fra-1在胶质瘤中的增殖指数pi对及1h-mrs各代谢产物比值进行相关性分析。结果:β-catenin在正常脑组织内仅在细胞膜内存有少许的表达,表现为棕黄色染色,在低级别胶质瘤内主要表达在胞浆内,高级别胶质瘤内表达于细胞核内。低级别胶质瘤43例,β-catenin的低表达为30例,高表达为13例,高表达率为30.2%。高级别胶质瘤44例,β-catenin的低表达为19例,高表达为25例,高表达率为56.8%。高低级别组胶质瘤内β-catenin的表达差异存在统计学意义。fra-1在低级别胶质瘤内低表达为34例,高表达为9例,高表达率为20.0%,fra-1在高级别胶质瘤内低表达为18例,高表达为26例,高表达率为59.1%,fra-1在高低级别胶质瘤内表达的差异存在统计学意义。β-catenin与fra-1在胶质瘤内的差异表达与性别、年龄、肿瘤的大小、肿瘤发生的位置无关。β-catenin与fra-1的在胶质瘤内的表达成正相关。1h-mrs各代谢物与β-catenin、fra-1在胶质瘤细胞内的增殖指数pi进行pearson相关性检验发现,cho/cr同β-cateninpi呈正相关,naa/cr与β-cateninpi呈负相关;cho/naa与β-cateninpi呈正相关。与上述结果相仿,cho/cr同fra-1pi呈正相关;naa/cr与fra-1pi呈负相关;cho/naa与fra-1pi呈正相关。结论:本研究通过对胶质瘤患者标本进行免疫组化分析,发现胶质瘤侵袭性相关的β-catenin及fra-1蛋白在不同级别胶质瘤级别中的差异性表达,证实了β-catenin及fra-1蛋白这两种因子参与了胶质瘤的发生及侵袭能力的增加。又通过对1h-mrs结果与β-catenin及fra-1表达相关性研究发现,cho/naa及cho/cr与β-catenin级fra-1蛋白在胶质瘤内的表达成明显的正相关,naa/cr与其表达成明显的负相关,从细胞增殖,细胞的代谢两个方面证实了β-catenin、fra-1蛋白的表达及1h-mrs可以从不同的角度评价肿瘤的侵袭性,并相互联系。第三部分wnt3a/β-catenin与fra-1调控胶质瘤侵袭性的分子机制研究目的:通过上面关于人胶质瘤侵袭性的研究已经表明β-catenin、fra-1在不同级别胶质瘤中的表达具有差异性,并对胶质瘤的的侵袭性具有评价作用。以前的研究表明上皮间质化是恶性肿瘤发生转移及侵袭的重要过程,而fra-1是上皮间化(emt)中的主要因子。然而,fra-1在神经胶质瘤的调节机制尚不清楚。wnt/β-catenin号转导通路影响细胞的存活、增殖能力、转移能力和细胞极性。wnt/β-catenin信号传导通路的作用已被很多研究证实,但由于wnt/β-catenin信号转导在神经胶质瘤中胶质瘤侵袭能力的重要影响,因此鉴别该信号传导通路的靶向基因有助于更好地了解该信号传导通路的作用机制。本研究旨在通过一系列的分子生物学实验研究fra1与wnt/β-catenin对胶质瘤侵袭性能力影响的作用机制,证明wnt/β-catenin与fra-l作为信号传导轴在神经胶质瘤侵袭能力发展中的关键作用,为恶性胶质瘤提供新的治疗靶点。方法:1在不同浓度wnt3a条件下处理u-251和u-87细胞后,对其上皮标志物e-cadherin和zo-1以及间质标志物vimentin和fibronectin进行qt-pcr及蛋白印记法检测其mrna及蛋白水平的表达差异。2采用免疫荧光、qt-pcr及蛋白印记法研究外源性wnt3a存在与否及沉默β-catenin与否状态下,胶质瘤细胞中vimentin的mrna及蛋白水平的表达差异。3研究外源性wnt3a存在与否的情况下,对emt相关主要因子进行qt-pcr及蛋白印记法检测其在胶质瘤细胞中的表达差异。4通过将胶质瘤细胞暴露在gsk-3β特异性抑制剂(licl和chir99021)前,对其进行qt-pcr及蛋白印记法检测fra1的mrna和蛋白水平。5首先通过荧光素酶实验验证在不同浓度的wnt3a条件处理下,fra1启动子(-2500/+1)转录活性的差异,再通过构建不同长度的及存在tcf/lef结合位点突变基因的fra1的启动子,在外源性wnt3a存在与否的条件性进行荧光素酶反应检查不同启动子的转录活性差异。6对胶质瘤细胞进行外源性wnt3a存在与否的处理,选择加入β-catenin和igg抗体进行染色质免疫共沉淀,在通过qt-pcr技术研究fra1启动子在不同条件下的表达差异。7通过对过表达fra1质粒及fra1-sirna转染的胶质瘤细胞进行蛋白质印迹实验,研究emt相关主要因子在蛋白水平的表达差异。8对fra1-sirna及β-catenin-sirna进行转染的胶质瘤加入或者不加入外源性wnt3a细胞进行培养,再通过对其进行细胞伤口愈合实验及细胞侵袭实验,研究不同状态下胶质瘤细胞的侵袭能力的差异。9通过对沉默fra1(fra1-sirna对胶质瘤细胞进行转染)的胶质瘤细胞wnt3a存在与否状态进行qt-pcr及蛋白质印迹实验,研究emt相关主要因子的的表达差异。10cck法检测在外源性wet3a存在与否及沉默或过表达fra1转染的胶质细胞暴露于顺铂的情况下的细胞生存状态的差异。11通过流式细胞术检查稳定转染wnt3a过表达及沉默fra-1的胶质瘤细胞,经过顺铂处理后细胞凋亡水平的差异。12稳定转染wnt3a过表达及沉默fra-1的胶质瘤细胞注入小鼠体内产生胶质瘤后,通过实验研究胶质瘤瘤体对不同浓度的顺铂的抵抗程度的差异。结果:1在神经胶质瘤细胞中,激活wnt/β-连环蛋白信号转导会诱导emt。在u-251和u-87细胞中,随着wnt3a剂量浓度的升高,vimentin和fibronectin在mrna水平和蛋白水平表达都升高,e-cadherin和zo-1的表达下降,免疫荧光结果显示在神经胶质瘤细胞中,wnt3a激活wnt/β-catenin信号转导,促进vimentin的表达,而通过使沉默β-catenin沉默来封闭β-catenin信号转导通路,会抑制vimentin的表达。这些结果表明wnt/β-catenin信号转导通路在神经胶质瘤emt中起促进作用。在激活wnt/β-catenin信号转导后,通过wnt3a处理后,emt相关所有的因子都有不同程度的升高,但fra1的mrna和蛋白质水平都显著上调。2使用gsk-3β特异性抑制(licl和chir99021对胶质瘤细胞进行处理后,fra1的mrna和蛋白水平增加(图2a和2b)。同时,荧光素酶基因报告实验表明暴露wnt3a会以剂量依赖方式增加fra1启动子的转录活性(-2500/+1),并进一步证实证实fra1在蛋白水平上的增加。通过不同长度及含有tcf/lef突变结合位点的启动子进行的荧光素酶基因报告实验表明当-1500和-500区域缺失时,fra1丧失对wnt3a处理的应答能力。dna片段(-1500/-500)含有两种假定的tcf/lef结合位点。后位突变能够显著降低wnt3a诱导的报道分子的活性。chip试验进一步证明在转录开始位点的上游,β-catenin/tcf/lef转录复合物能直接与fra1启动子结合,并在wnt3a刺激下,该结合增强。这些结果表明wnt/β-catenin号转导通过反式激活上调fra1的表达。3 Fra1过表达会下调上皮标记物的表达并上调间质标记物的表达,而沉默Fra1后情况相反。无论沉默Fra1或β-catenin都会减弱U-251细胞的迁移和入侵能力。在胶质瘤U-87细胞中,敲除β-catenin减弱Wnt3a胶质瘤侵袭性的促进作用。Wnt3a诱导的U-251cells的迁移和侵袭性在沉默Fra1后而被完全消除。沉默Fra1表达后后,Wnt3a诱导的EMT-TFs上调作用明显减弱。以上的研究结果表明在神经胶质瘤细胞中,Wnt3a诱导的Fra1上调在EMT中必不可少,而EMT是由Wnt/β-连环蛋白信号转导所诱导。4胶质瘤细胞在Wnt3a作用下顺铂抵抗值是对照组的1.67倍。过表达的Fra1促进顺铂抵抗,IC50是对照组的1.44倍。然而,沉默Fra1会增强胶质瘤细胞对顺铂的敏感性,IC50降低到0.69倍。稳定性沉默Fra1并且过表达Wnt3a的U-251细胞与对照组相比,在激活Wnt/β-catenin信号转导通路会降低胶质瘤细胞对顺铂诱导的细胞凋亡但在沉默Fra1后,这种抵抗作用没有显示,在上述方法处理的U87的胶质瘤细胞中也得到了相同的结果。裸鼠移植瘤实验研究发现表明Wnt3a过表达会增强胶质瘤对顺铂的抵抗,并沉默Fra1会增强神经胶质瘤细胞对顺铂的敏感性。重要的是,Fra1沉默会抑制Wnt3a对顺铂的抵抗作用。总之,Wnt/β-连环蛋白/Fra1轴在神经胶质瘤细胞的顺铂抵抗中发挥关键作用。结论:本研究通过对胶质瘤细胞进行不同浓度Wen3a、沉默β-catenin及Fra-1的处理,然后检测EMT相关的mRNA及蛋白的表达水平,从而证实Wnt/β-catenin信号转导通路能通过上调Fra-1的表达诱导神经胶质瘤细胞发生EMT。又通过构建不同长度及Tcf/Lef突变型基因的Fra-1启动子用于荧光酶素反应实验及免疫共沉淀实验进一步研究表明Wnt/β-catenin信号转导通路通过直接结合来激活Fra-1转录,而且发现β-catenin-Tcf/Lef与WRE的转录复合物位于Fral启动子的近侧区。通过体内细胞生存及侵袭实验,裸鼠瘤体抑制实验证实不同表型下,顺铂的抵抗能力,表明Fra1在介导神经胶质瘤入侵时发挥关键性作用,而神经胶质瘤入侵是由Wnt/β-catenin信号转导所诱导。因此,Wnt/β-catenin信号转导和Fra-l之间存在相关性,这为开发神经胶质瘤的新型生物标记物和治疗靶点提供可能性。