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棉铃虫(Helicoverpa armigera Hübner)是一种重要的世界性棉花害虫。自转Bt基因棉花大面积种植以来，棉铃虫得到了有效的控制，并且减少了化学农药的使用。在Bt棉花长期选择压力下，棉铃虫对Bt棉花的抗性风险问题不容回避。棉铃虫氨肽酶N(Haapnl)和钙粘蛋白(Ha_BtR)是Bt毒素Cry1Ac作用过程中的两个重要受体，Haapnl以及Ha_BtR基因突变都能使棉铃虫对Cry1Ac产生抗性。本文将Haapnl和Ha_BtR基因的一段双链RNA注射到棉铃虫四龄幼虫体内，测定单个基因或两个基因沉默后对Cry1Ac活化毒素和原毒素毒力的影响，以期探明棉铃虫Haapnl和HaBtR这两个受体在Bt毒素Cry1Ac毒杀过程中的相互作用，有助于对Bt毒素作用机理和抗性机理进行更全面的认识。
1.氨肽酶N(Haapnl)和钙粘蛋白（Ha_BtR）dsRNA注射剂量的确定
通过RT-PCR扩增出Haapnl和Ha_BtR基因片段，并以此作为模板合成dsRNA。用微量进样器将双链RNA导入到4龄幼虫淋巴液中，分别注射Haapnl、Ha_BtRdsRNA1μg、3μg、6μg和12μg，注射ES缓冲液(elution solution)作为对照。48小时后实时荧光定量PCR检测结果表明，注射1μg Haapnl dsRNA后，mRNA表达量下降为对照的49％;注射1μg Ha_BtR dsRNA后，表达量下降为对照的70％。注射1μg dsRNA剂量的基因沉默效率高于其他剂量，因此确定1μg dsRNA为本研究采用的注射剂量。
2.Haapnl和Ha BtR单个基因被干扰后对Cry1Ac毒力的影响
在棉铃虫敏感品系(SCD)中，Cry1Ac活化毒素对注射HaapnldsRNA幼虫的毒力显著低于对注射ES幼虫的毒力；而Cry1Ac原毒素对注射HaapnldsRNA幼虫与注射ES幼虫的毒力无显著差异。Cry1Ac活化毒素以及原毒素对注射Ha_BtRdsRNA幼虫与注射ES幼虫的毒力均无显著差异。
在敏感品系SCD与钙粘蛋白突变品系SCD-r1杂交后代(F1)中分别沉默Haapnl和HaBtR基因，以研究在Ha_BtR低表达的条件下其对Cry1Ac毒力的影响。Cry1Ac活化毒素对注射Haapnl dsRNA幼虫的死亡率低于注射ES幼虫的死亡率（差异极显著），而原毒素对注射Haapnl dsRNA和ES的幼虫的毒力无显著差异。注射Ha_BtRdsRNA幼虫对Cry1Ac活化毒素（在第四天和第五天）及原毒素（在第三天和第四天）的敏感性显著低于注射ES的幼虫。
3.Haapnl和Ha_BtR两个基因同时被干扰后对Cry1Ac毒力的影响
在SCD品系幼虫中注射Haapnl和Ha_BtRdsRNA混合液（各1μg）后，HaapnlmRNA和Ha_BtR mRNA表达量分别下降为对照的54％和63％。干扰后的幼虫对Cry1Ac活化毒素和原毒素的敏感性均显著下降，在第五天的差异达到极显著。
在F1幼虫中注射Haapnl和HaBtRdsRNA混合液（各1μg）后，两个基因的表达量分别下降为对照的67％和36％。Cry1Ac活化毒素对干扰后的幼虫的毒力（在第4天和第5天）低于对注射ES幼虫的毒力（差异极显著）；Cry1Ac原毒素对干扰后幼虫的死亡率也低于对照组的死亡率（在第5天差异极显著）。
因此，棉铃虫幼虫Haapnl表达量下降能够使Cry1Ac毒力显著下降，Ha_BtR表达量下降对Cry1Ac毒力的影响有限；与单个基因被dsRNA沉默相比，Haapnl和Ha_BtR同时被dsRNA沉默对Cry1Ac毒力的影响更大。上述研究表明，棉铃虫Haapnl和Ha_BtR作为Cry1Ac的功能受体共同参与Cry1Ac的毒杀作用，其中的任何一个基因产生突变都可能导致棉铃虫对Cry1Ac产生抗性。