背景和目的流行性感冒（简称流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,主要经空气飞沫传播。流感病毒有甲、乙、丙三型,其中甲型所引起的流感流行最为广泛和严重,乙型常表现为小流行,丙型则多引起小儿散发病例。我国虽将流感归属于法定传染病丙类,但疾病一旦流行,传播快、波及面广,对人民健康及劳动生产力影响很大,尤其对年老体弱者及婴幼儿的威胁更大。据世界卫生组织公布的资料显示,每年有6～12亿人患流感,有300～500万人因流感引起严重的并发症,25～50万人因流感死亡。因此,流感的快速诊断对及时有效的抗病毒治疗、减少抗生素滥用、减轻患者不必要的经济负担具有重要的意义。爱思普林^TM流感A&B-N快速检测试剂是根据酶免疫层析染色技术,通过1个检测卡对患者呼吸道鼻拭子中的A型和B型流感病毒核蛋白抗原进行同时检测。本研究旨在评价酶免疫层析法在流感疑似患者中进行床旁检测（POCT,Point of CareTest）的临床价值。研究对象与方法1.研究对象为2008年1～3月北京地区4家医院的具有流感样症状的门诊患者,4家医院分别为北京协和医院、北医三院、北京安贞医院及北京儿童医院。入选病例需满足以下条件:发热始于3d之内,体温≥38℃,伴有下列症状中的2项（含）以上:咽喉痛、咳嗽、头痛、肌肉酸痛、畏寒及全身不适。2.标本收集及保存根据入选标准对合格病例取其双侧鼻拭子标本。其中一侧鼻拭子标本在诊室内利用爱思普林^TM流感A&B-N卡式试剂盒进行流感病毒A及B型抗原的快速检测,另一侧鼻拭子标本放入专用无菌管（含3ml病毒转运液）内置4℃运送及保存,如24h不能进行细胞培养检测,则标本置-80℃冻存。3.标本的检测3.1.流感病毒抗原的快速检测在诊室内即刻进行（point of care test,POCT）:将鼻拭子在专用榨取管内处理后,滴加30ul标本榨取液至卡式盒的标本检查孔上,按下含基质展开液的凸部,使反应得以进行,15min后读取结果。3.2.流感病毒的培养相对集中进行,每份标本取0.5ml接种于长满的单层MDCK细胞上离心后培养48～72h。无水甲醇固定后分别采用FITC标记的流感病毒A型及B型单克隆抗体染色,在倒置荧光显微镜下观察结果。结果免疫层析法检测甲型及乙型流感病毒的阳性率分别为17.5%和14.2%,细胞培养甲型及乙型流感病毒的阳性率分别为16.3%和18.3%;相对于细胞培养鉴定,免疫层析法床旁检测甲型流感病毒的敏感性、特异性、总符合率、阳性及阴性预测值分别为96.5%、97.8%、97.6%、89.6%和100%,乙型流感病毒的敏感性、特异性、总符合率、阳性及阴性预测值分别为77.5%、100%、95.9%、99.3%和95.2%。结论基于免疫层析法的流感病毒快速检测（诊室内检测）能为临床提供早期、快速的病原学诊断。背景和目的呼吸道病毒可分为两类：一类是指仅侵犯呼吸道引起呼吸道局部病变，另一类则以呼吸道为侵入门户、主要引起呼吸道外组织器官病变的病毒。．呼吸道病毒包括正粘病毒科（Orthomyxoviridae）中的流感病毒；副粘病毒科（Paramyxoviridae）中的副流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒以及其它病毒科中的一些病毒，如腺病毒、风疹病毒、鼻病毒、冠状病毒和呼肠病毒等。据统计，急性上呼吸道感染约70～80％由病毒引起，病毒性呼吸道感染病程一般呈自限性，但某些病毒，如呼吸道合胞病毒，甲型流感病毒，副流感病毒3型，腺病毒对于老幼体弱，免疫功能低下者则可能合并或继发细菌性感染，导致严重的呼吸道疾病，不但加重了患者的经济负担，偶尔也会危及生命。呼吸道感染的临床表现缺乏特异性，抗生素对于病毒感染无效，且抗生素的滥用可诱发细菌耐药。因此，病原学诊断对呼吸道感染的临床诊断及治疗都是十分重要的呼吸道病毒的检测有病毒的分离培养、核酸分子生物学检测、病毒抗原检测及双份血清抗体滴度对比检测等多种方法，病毒的分离培养鉴定虽然相对繁琐，但仍是目前公认的“金标准”。为了提高病毒分离培养的效率，本研究旨在建立起常见数种呼吸道病毒的多细胞快速离心培养体系，提高病毒培养及鉴定的时效性及临床应用价值；同时对部分临床标本进行检测分析。研究对象和方法1．研究对象1.1．为由美国培养物保藏中心（ATCC）和国家CDC提供的甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒的标准株。1.2．同时还收集了2007年11月-2008年4月在北京地区四家综合性医院发热门诊和儿科病房就诊的急性呼吸道感染患者、无呼吸道症状的健康志愿者的鼻拭子标本，以及行纤维镜检查的非急性呼吸道感染患者的肺泡灌洗液标本进行细胞培养鉴定。2．方法2．1．标本收集及保存根据入组标准对合格病例采集两侧鼻拭子标本或肺泡灌洗液。标本采集后放入含3ml病毒转运液的专用试管中，置4℃冰箱冷藏，每日由专人冷藏运送至协和医院病毒实验室，24h内进行分离培养，否则置．80℃冰箱冻存。2．2．标本的检测采用离心培养法，把标本分别接种于长满的含单层MRC-5细胞（人胚肺成纤维细胞）、Vero-E6细胞（非洲绿猴肾细胞变种）、HEp-2细胞（人喉癌上皮细胞）及MDCK细胞（犬肾细胞）的24孔细胞培养板中，离心细胞培养板1h，然后置35℃和5％CO2的温箱温育lh，吸去接种物后加入病毒生长维持液后继续同样条件培养。每日在倒置显微镜下观察细胞病理改变（CPE），有CPE的细胞孔将部分病变细胞用胰酶消化或吸管直接吹吸下来，PBS洗涤离心后滴片固定后行免疫荧光抗体染色鉴定，无CPE改变的细胞孔培养至7d后也采用PBS洗涤并固定，免疫荧光抗体染色鉴定。结果1．标准毒株流感病毒甲型及乙型接种于MDCK细胞后在12～48h即可观察到明显的CPE：副流感病毒1型接种于Vero-E6细胞后在48-72h即可观察到明显的CPE：呼吸道合胞病毒接种于HEP-2细胞后48～72h出现明显的CPE：腺病毒接种于MRC-5及Veto-E6细胞后48～72h均表现出明显的CPE。相应的CPE经单克隆荧光抗体染色结果与毒株标识相一致。2．2008年11月～2009年4月间，采集上呼吸道感染患者鼻拭子标本1088例，培养及鉴定出甲型流感病毒174例、乙型流感病毒197例；采集下呼吸道感染患者鼻拭子标本30例，培养及鉴定出呼吸道合胞病毒8例、乙型流感病毒1例；采集无呼吸道感染、但因肺部占位性病变或肺间质性病变（DPLD）而进行纤维支气管镜检及肺泡灌洗的患者44例，未培养及鉴定出常见呼吸道病毒；采集无呼吸道感染的健康志愿者鼻拭子标本40例，均未培养及鉴定常见的呼吸道病毒。结论采用多种细胞系、离心细胞培养法对呼吸道分泌物中的数种常见呼吸道病毒的快速分离培养及鉴定是可行的，而且时效性也相对较高，对临床诊断及治疗有辅助作用。背景和目的流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，患者临床症状轻重不一，有严重并发症的可导致死亡。据世界卫生组织报道，全世界每年因患流感而致严重疾病的人数约为300～500万，死亡人数可达25～50万。预防流感的最佳途径是接种流感疫苗，抗流感病毒药物可作为预防及治疗流感的有效手段。目前，经美国FDA批准的抗流感病毒药物有四种，即金刚烷胺、金刚乙胺、扎那米韦和奥司他韦。前两种药物仅对甲型流感病毒有效，而且在治疗过程中极易出现耐药现象；而神经氨酸酶抑制剂奥司他韦及扎那米韦则是目前化学性预防或治疗流感病毒感染的最有效药物。但近年来，世界各地均检测出对神经氨酸酶抑制剂耐药的流感病毒株，因此，开展抗流感病毒药物对流行株敏感性的监测显得尤为必要。本研究旨在建立流感病毒临床药物敏感性试验的技术平台，即蚀斑减数试验体系（PRA，plaque reduction assay），并对四种药物在部分流感病毒阳性样本的体外敏感性进行了检测，以期为临床提供有价值的信息。方法1．蚀斑检测及病毒PRA接种量滴定采用离心细胞培养法，将部分流感病毒阳性分离物以系列稀释的浓度接种于MDCK细胞并覆盖含胰酶和1．2％艾维素的MEM混悬液培养72h，固定并染色细胞面后确定PRA接种的病毒浓度，即30～60 PFU／ml;2．蚀斑减数试验测定药物的IC₅₀值按预滴定的病毒浓度接种MDCK细胞，加入系列稀释的4种抗病毒药物及艾维素覆盖层培养，同时设立阳性、阴性及药物对照，培养72h后固定并染色鉴定PRA结果，即药物是否有效和药物相应的IC₅₀值。结果1．5份流感病毒阳性分离物以艾维素为覆盖物进行细胞培养72h，经固定及染色后均形成了明显的空斑。2．8份随机抽取自2001-2008年流感病毒甲／乙型阳性分离株按病毒预先滴定的接种量进行PRA检测，结果显示奥司他韦（达菲）对甲型流感病毒IC50值为0．064～0。128 ug／ml，金刚烷胺为0．5 ug／ml，表现出较佳的体外药物敏感性，但后者差于前者。利巴韦林和板蓝根对甲型流感病毒不敏感或无抗病毒作用；奥司他韦（达菲）、金刚烷胺、利巴韦林和板蓝根对乙型流感病毒均无抗病毒作用。结论1．以艾维素为覆盖层的蚀斑形成方法能对流感病毒进行半定量分析；2．奥司他韦对甲型流感病毒有效，对乙型流感病毒未显效：金刚烷胺对甲型流感病毒有效，但已有耐药株出现：利巴韦林及板蓝根对流感病毒甲／乙型均无效。