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隐球菌性脑膜炎（Cryptococcal Meningitis）是一种严重危害人类生命健康且不能被有效治疗的真菌疾病。普遍存在于环境中的干燥隐球菌菌体及其担孢子,可通过呼吸道吸入并侵染免疫力缺陷或低下人群,如AIDS患者、癌症患者、器官移植患者或新型冠状病毒肺炎患者等。此类人群由于免疫系统不健全而不能对吸入的隐球菌进行有效清除进而导致隐球菌侵袭肺部,而后隐球菌又随血液循环侵染人体其他器官,最终穿透血脑屏障感染中枢神经系统,引发致命的隐球菌性脑膜炎,导致每年数十万人死亡。对新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）形态发育及毒力机制进行深入解析有助于我们寻找新的药物靶点并用于隐球菌病治疗。F-box蛋白所参与的泛素蛋白系统特异性地降解真核细胞内的大多数蛋白,其中底物蛋白的特异性降解由F-box蛋白决定。F-box蛋白对维持生物体生理稳态至关重要,不仅影响动植物的生长发育,与癌症、糖脂紊乱等相关疾病的研究治疗息息相关,并且在真菌生长、有性生殖、毒力等方面也扮演着非常重要的角色。本课题对新型隐球菌F-box蛋白Cdc4时空表达和其在新型隐球菌形态发育、逆境胁迫以及致病性中的作用进行了探究,得到了以下结果:1.CDC4基因鉴定与时空表达分析我们对CDC4进行基因序列分析发现:CDC4基因编码区全长3126 bp,包含3个内含子和4个外显子,编码一全长为991个氨基酸的蛋白Cdc4;对Cdc4进行蛋白结构域预测分析发现其含有1个F-box蛋白结构域和8个WD40结构域,表明Cdc4为典型的F-box蛋白。接着,我们对新型隐球菌F-box蛋白Cdc4进行时空表达分析:在Cdc4空间定位分析中,通过荧光观察GFP-Cdc4融合表达菌株发现绿色荧光在GFP-Cdc4菌株的细胞核与细胞膜上均有定位,且不因压力应激条件的影响发生转移;GFP-Cdc4菌株交配实验发现绿色荧光定位于交配菌丝、担子头以及担孢子的细胞核和细胞膜上,进一步说明Cdc4在新型隐球菌中定位于细胞核和细胞膜。通过qRT-PCR方法和构建PCDC4-mCherry菌株诱导交配,分析了CDC4在新型隐球菌交配早期以及各发育时期的表达情况,结果发现CDC4在新型隐球菌交配早期以及在交配菌丝、担子头和担孢子形态均有表达,且在交配早期的表达呈先升高后下降的趋势,由此推测CDC4可能在新型隐球菌交配过程中发挥作用。2.CDC4基因敲除、互补及超表达菌株表型分析为进一步研究Cdc4的功能,我们构建了cdc4Δ突变体菌株、CDC4互补菌株以及CDC4OE超表达菌株来探究Cdc4在新型隐球菌逆境胁迫、有性生殖以及致病性中的作用。经典毒力因子检测发现隐球菌野生型菌株、cdc4Δ突变体菌株、CDC4互补菌株及CDC4超表达菌株在荚膜形成、色素产生以及37oC条件下生长没有显著差异,表明CDC4基因不影响新型隐球菌三种经典毒力因子的形成。在应激压力检测中,我们发现CDC4OE超表达菌株对SDS敏感,但对刚果红不敏感,表明CDC4过表达会影响新型隐球菌细胞膜的完整性。交配实验发现cdc4Δ突变体菌株交配后能产生菌丝和担子,但不能产生担孢子,表明CDC4基因缺失后新型隐球菌有性产孢过程受阻,推测CDC4基因在新型隐球菌有性生殖过程中扮演重要角色。为此,我们构建了核定位的Nop1-mCherry荧光菌株对cdc4Δ突变体菌株交配产孢受阻原因进行初步探究,通过荧光共聚焦观察交配过程中细胞核发育情况,发现CDC4缺失后新型隐球菌交配产生的担子内只有1个或2个细胞核。由此推测,CDC4缺失后新型隐球菌在交配过程中只能进行细胞核融合但不能进行细胞核分裂导致减数分裂过程受阻,最终导致不能产生4条担孢子链,从而影响了新型隐球菌的有性生殖过程。3.小鼠致病性分析小鼠致病性实验发现感染cdc4Δ突变体菌株的小鼠在实验终止时（接种后80天）全部存活且未发病;CFU统计和组织切片结果发现感染cdc4Δ突变体菌株的小鼠肺部有少量隐球菌细胞存在,但肺泡组织未遭到破坏,脑部和脾部则没有发现隐球菌细胞以及遭到破坏的痕迹。对感染cdc4Δ突变体菌株不同时间的小鼠进行肺部CFU统计和组织切片观察,结果发现随着时间的推移,感染野生型菌株的小鼠肺部组织载菌量是呈上升趋势,且肺部组织破坏严重;与之相反,感染cdc4Δ突变体菌株的小鼠肺部组织的载菌量维持在一个较低且持久水平,且小鼠肺部组织依然保持完整。这些结果表明cdc4Δ突变体菌株致病性丧失。综上所述,CDC4基因缺失导致新型隐球菌丧失交配后产孢能力和致病性,表明F-box蛋白Cdc4在新型隐球菌的有性生殖及致病性中发挥重要的作用。