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第一部分:对乏氧和辐射应答的融合性启动子载体的构建 目的 利用乏氧应答元件和放射敏感性调控序列与治疗基因相耦联,在肿瘤受照射时诱导治疗基因仅在肿瘤内表达,以提高治疗比率。本研究拟构建乏氧-辐射双敏感性启动子载体,以进一步提高肺癌放射-基因治疗效果。 材料和方法 采用酶切、连接、转化、PCR等方法,分别构建pDNA.miniCMV. EGFP, pDNA.HRE.miniCMV.EGFP, pDNA.CArG.miniCMV.EGFP,pDNA. HRE.CArG.miniCMV.EGFP和pDNA.miniCMV.HSVtk,pDNA.HRE.miniCMV.HSVtk, pDNA.CArG.miniCMV.HSVtk和pDNA.HRE.CArG.miniCMV.HSVtk质粒。 结果 用限制性内切酶NruⅠ和EcoRⅤ双酶切pcDNA3.1(-)质粒,自连后产牛pDNA质粒;经酶切、连接、转化等方法,在pDNA质粒的Acc65Ⅰ和HindⅢ位点之间插入miniCMV片段,并引入—XhoⅠ位点,在MfeⅠ和BamHⅠ位点间插入HRE片段,BamHⅠ和Acc65Ⅰ位点间插入CArG片段,XhoⅠ和HindⅢ位点间插入EGFP或HSVtk基因片段。构建的质粒经酶切鉴定和上海生工测序鉴定,序列正确。 结论 我们构建成功包含HREs和CArG元件的融合性基因启动子,为进