研究背景脓毒症是指由感染引起的全身炎症反应综合征。脓毒症病死率高,是危重症监护病房内最常见的死亡原因之一,并且发病率逐年升高。脓毒症时免疫细胞凋亡及其后续的免疫抑制是导致脓毒症患者死亡的重要原因。其中,淋巴细胞在机体的免疫保护中发挥了重要的作用。已有大量研究显示：脓毒症时可出现免疫器官及外周血中大量淋巴细胞凋亡,这些细胞的凋亡又可继发严重的免疫抑制。新的研究显示,细胞外组蛋白在脓毒症发病及致死过程中发挥了重要作用,被认为是脓毒症治疗的一个潜在靶点。我们的前期研究显示,脓毒症过程中大量释放的细胞外组蛋白可通过线粒体损伤介导淋巴细胞凋亡。葡萄籽原花青素(GSPE)是从葡萄籽中提取的原花青素,含有大量的酚羟基。抗氧化的多酚类化合物有一个非常重要的功能,它们可以清除氧自由基,并减少膜脂质体过氧化作用。研究显示原花青素具有广泛的生物学效应,如抗氧化性、抗炎及线粒体保护作用,而线粒体损伤是组蛋白介导淋巴细胞损伤的重要途径,因此我们推断原花青素可能具有抑制组蛋白介导的淋巴细胞凋亡作用,并通过该研究明确GSPE对组蛋白介导淋巴细胞凋亡的作用及机制。研究目的1.明确原花青素是否可以抑制组蛋白诱导的淋巴细胞凋亡；2.探讨原花青素是否通过清除氧自由基,p38通路和线粒体途径保护保护组蛋白诱导的淋巴细胞凋亡。研究方法1.分离人血淋巴细胞经静脉抽取健康志愿者外周血20mL,肝素抗凝,与PBS等比例稀释混匀后平均分为5管,分别缓慢加入装有5m1淋巴细胞分离液的离心管上部,设置温度20℃,离心机2000rpm离心30min,吸取中间富淋巴细胞的白膜层,经PBS洗涤1遍离心后,用不含血清的1640培养基重悬全部淋巴细胞至同一个EP管中,并计数备用。2.药物处理淋巴细胞来源于健康志愿者全血,经淋巴细胞分离后,培养于1640培养液中。淋巴细胞分为4个组,培养于6孔板中,密度为1×106个/孔。Ⅰ空白对照组；Ⅱ组蛋白处理组(50μg/ml);处理组(2μg/ml); IVGSPE+组蛋白处理组。Ⅲ和Ⅳ组先分别予GSPE处理2小时,Ⅱ与Ⅳ组再与组蛋白50ug/mL处理2.5h。3.细胞分析a)细胞活力测试细胞生存能力用CCK8[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]测定。将淋巴细胞按密度为1.25×105细胞/孔接种在96孔板,每孔100μ1。经药物处理后,采用CCK8法检测细胞活力。b)人外周血淋巴细胞凋亡的检测将处理好的人外周血淋巴细胞1000rpm离心10min,弃上清,加入1mLPBS,洗涤重悬,离心,弃去上清,AnnexinV-FITC/PI避光孵育15min, PBS重悬细胞后用流式细胞仪检测每管淋巴细胞的凋亡率。c)线粒体内膜损伤检测将处理好的人外周血淋巴细胞离心弃去上清,加入罗丹明123(Rhodamine123)染色剂至终浓度1μM,在37℃避光染色30min, PBS洗涤2遍并重悬细胞后,流式细胞仪检测线粒体膜电位。d)活性氧(ROS)生成量检测将处理好的淋巴细胞离心弃去上清,加入DCFH-DA染色剂至终浓度1umol/ml,于37℃避光孵育30min, PBS洗涤2遍并重悬细胞后,流式细胞仪检测ROS生成量。4. Western Blot法测定淋巴细胞中相关蛋白的表达a)线粒体膜蛋白Bcl-2的检测将处理好的细胞1200rpm离心10min,经PBS洗涤后弃去上清,加入细胞裂解液(RIPA)于冰上裂解30min,提取总蛋白,14000rpm离心后取上清,变性后存储于-20℃。以GAPDH为内参蛋白调整所有蛋白样品至等浓度后上样,western blot免疫蛋白印迹法检测各组Bcl-2蛋白的表达量。b)细胞信号通路p38MAPK磷酸化检测将处理好的细胞1200rpm离心10min,经PBS洗涤后弃去上清,加入细胞裂解液(RIPA)于冰上裂解30min,提取总蛋白,14000rpm离心后取上清,变性后存储于-20℃。以GAPDH为内参蛋白调整所有蛋白样品至等浓度后上样,western blot免疫蛋白印迹法检测各组p38MAPK磷酸化的表达量。c)凋亡蛋白Caspase3活化检测将处理好的细胞1200rpm离心10min,经PBS洗涤后弃去上清,加入细胞裂解液(RIPA)于冰上裂解30min,提取总蛋白,14000rpm离心后取上清,变性后存储于-20℃。以GAPDH为内参蛋白调整所有蛋白样品至等浓度后上样,western blot免疫蛋白印迹法检测各组凋亡蛋白Caspase3活化的表达量。5.统计学方法数据结果用均数±标准差(X±s)表示,采用SPSS13.0软件进行统计分析。单因素方差分析(one-way ANOVA)用于各组间均数差异显著性的比较,2-tailedStudent’st检验用于组间两两比较,P值小于0.05表示差异有统计学意义。研究结果1.GSPE对淋巴细胞活力的影响GSPE对淋巴细胞活力没有明显的改变,差异没有统计学意义。与对照组比较,组蛋白组在浓度达到50μg/ml时淋巴细胞活力明显下降(P<0.05)。2.GSPE对组蛋白诱导的淋巴细胞凋亡的影响将GSPE预处理淋巴细胞2h后,再与组蛋白刺激2.5h。细胞凋亡率分析使用AnnexinV-FITC/PI染色和流式细胞分析仪。组蛋白组显示凋亡细胞的比例非常高,相比对照组(16.58±7.17% vs 3.15±1.06%,P<0.01)。组蛋白+GSPE组与组蛋白组比较,淋巴细胞凋亡率显著降低(7.03±1.93% vs 16.58±7.17%,P<0.01)。GSPE组淋巴细胞凋亡率为(2.74±1.98%)。3.GSPE降低组蛋白诱导的淋巴细胞内ROS的生成量组蛋白组和对照组相比,ROS强度显著增加,(2671.94±752.07 vs 1432.42±434.26,P<0.01)。组蛋白+GSPE组与组蛋白组比较,ROS生成量显著减少(2101.13±773.22 vs 2671.94±752.07, P<0.01)。GEPE组与对照组相比,ROS生成量没有明显降低(1274.97±434.25 vs 1432.42±434.26, P>0.05)。4.GSPE保护组蛋白介导的线粒体损伤与正常对照相比,组蛋白组的线粒体膜电位显著降低,(49.19±3.36 vs68.85±4.07,P<0.01),表明其线粒体损伤严重。组蛋白+GSPE组与组蛋白组比较,线粒体膜电位显著增加(66.83±3.3 vs 49.19±3.36, P<0.01)。GEPE组与对照组比较,线粒体膜电位没有明显下降(70.88±4.37 vs 68.85±4.07,P>0.05)。5.GSPE拮抗组蛋白引起的Bcl-2下调和caspase3活化Western blot结果显示组蛋白组B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)家族蛋白的表达量下降,但GSPE治疗组的Bcl-2的表达量相比组蛋白组明显上升,(P<0.05)。此外,GSPE预处理能中和组蛋白导致的Bcl-2下调(P<0.05)。组蛋白组活化的caspase3表达量较其他组显著增多,GSPE预处理可以降低组蛋白诱导的caspase3活化(P<0.05)。6.GSPE抑制组蛋白引起的p38磷酸化Western blot结果显示组蛋白磷酸化的p38表达量较对照组显著增多(P<0.05)。其次,GSPE预处理组的磷酸化的p38表达量较组蛋白组显著降低(P<0.05)。实验结论1.GSPE对细胞外组蛋白引起的人血淋巴细胞凋亡发挥了重要保护作用。2.GSPE可能通过抑制ROS产生、MAPK p38磷酸化、线粒体损伤及caspase3活化抑制组蛋白介导的淋巴细胞凋亡。