论文部分内容阅读
目的:对人脐带间充质干细胞(human umbilical cordmesenchymal stem cells,hUMSCs)的生物学特性进行鉴定,探讨复方麝香注射液在定向诱导hUMSCs向神经细胞分化的作用和条件,为中药诱导hUMSCs神经分化以及临床应用提供理论和实验基础。
方法:取足月妊娠剖宫产健康新生儿的脐带,以D-Hanks充分冲洗,剔除脐动脉和脐静脉,将剩余的脐带间质组织切割成1 mm3大小的组织块,0.2%胶原酶Ⅱ消化,在含有20%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、2 ng/ml表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)、25 mM左旋谷氨酰胺(L-glutamine,L-Glu)、100 U/ml青霉素,100 μg/ml链霉素的DMEM/F12中培养。观察原代培养细胞的形态学变化,当细胞达80%~90%汇合时,加入0.25%胰酶-1 mMEDTA消化细胞,并传代。
收集消化后的细胞,以流式细胞法行细胞表型检测,包括PE-CD13,PE-CD29,PE-CD31,PE-CD44,PE-CD73,PE-CD105,PE-CD133,PE-CD166,FITC-CD34,FITC-CD45,FITC-CD90,FITC-HLA-ABC(HLA-I)和FITC-HLA-DR(HLA-II),并以FITC或PE标记的小鼠IgG1作为同型对照。
以含10%FBS、10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的培养基预诱导24h后,更换为分别含5、10、15、20、25g/L复方麝香注射液的无血清培养基进行神经分化诱导,并用免疫细胞化学检测神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、微观相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达。各组结果用SPSS 15.0 for Windows进行统计分析。结果:细胞接种后24~48 h即可见有少量形态各异的贴壁细胞,6~10 d以后见成纤维细胞样克隆形成,克隆呈放射状生长。在接种2周时,细胞可达到80%~90%汇合程度;经消化后按1:2~1:3的比例将细胞传代。传代后数小时内可见其迅速贴壁,5-6 d后重新达到90%~95%汇合程度的细胞在低倍镜下呈排列紧密的漩涡样结构。
流式细胞检测显示这些细胞表达CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106和CD166,不表达CD31、CD34、CD38、CD45、CD133。对组织相容性免疫表型的分析显示hUMSCs不表达HLA-DR(HLA-II)抗原,而表达HLA-ABC(HLA-I)抗原。
经过含不同浓度复方麝香注射液的DMEM/F12培养基诱导5 d后,各诱导组中均有分化的神经样细胞出现。5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L各组中,显微镜每随机视野NSE阳性细胞数分别为19.00±3.61、66.60±5.37、60.20±10.06、44.80±9.44、47.80±10.45,MAP-2阳性细胞数分别为9.20±3.27、53.40±10.92、59.40±10.41、46.60±8.88、46.80±8.93,以10g/L和15g/L组中的NSE、MAP-2阳性细胞数为最多。各诱导组中只可见很少数细胞呈GAFP弱阳性。
结论:本研究证实了人脐带富含MSCs,且可在体外进行分离、培养、扩增传代。10 g/L~15 g/L浓度复方麝香注射液可较好地诱导脐带间充质干细胞分化为神经元样细胞。