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1.研究目的彩色棉是一种成熟吐絮时纤维自身带有天然色彩的棉花。近年来，人们的健康和环保意识逐渐增强，天然彩色棉制品倍受人们青睐。然而，彩色棉纤维的颜色仅有绿色和棕色两大色系，颜色单调，远不能满足人们对于绚丽服饰的需求。由于缺乏除棕、绿两种颜色之外的其他颜色的种质资源，通过常规的杂交手段难以解决目前彩色棉颜色单调的问题。人们寄希望利用基因工程手段来改变彩色棉纤维的颜色，完成这项工作的前提是明确彩色棉纤维色素形成的分子机制。本研究利用2-DE结合质谱鉴定分析比较了彩色棉及其白色近等基因系棉纤维蛋白质组的差异，分离鉴定差异蛋白，为揭示彩色棉色素合成的分子机制及为利用基因工程手段改良彩色棉纤维色泽品质提供理论基础。2.结果与结论2.1利用差异蛋白质组学策略分析比较了棕色棉及其白色近等基因系棉纤维蛋白质组差异，利用MALDI-TOF/TOF质谱技术成功鉴定了3个纤维发育时期（12，18和24DPA）共计78个差异蛋白点。研究发现21个差异蛋白点与植物次生代谢途径相关，其中15个参与类黄酮物质的合成，且均在棕色纤维中表现上调；DMACA染色实验以及7个原花色素合成关键酶基因的qPCR分析表明，类黄酮在棕色棉纤维色素形成过程中起关键作用，推测原花色素与纤维颜色形成有关。本研究首次从蛋白质组学的角度明确了类黄酮在棕色棉纤维色素合成过程中的重要作用，也为类黄酮是棕色纤维中的色素物质这一假设提供了直接的证据。同时发现了一些在棕色纤维中下调的蛋白点，包括糖酵解、氧化还原平衡，细胞骨架和蛋白质代谢相关蛋白，推测棕色纤维中类黄酮化合物的活跃代谢影响了其它代谢途径的正常运作，一些纤维发育相关的蛋白，如ascorbate peroxidase、superoxide dismutase、actin、annexin和heat shock protein70等表现下调，是棕色棉纤维品质差的主要原因。2.2利用差异蛋白质组学策略分析比较了绿色棉及其白色近等基因系棉纤维蛋白质组差异，在3个纤维发育时期（12，15和24DPA）成功鉴定了25个差异蛋白点。这些差异蛋白点包括次生代谢、能量/碳水化合物代谢、细胞壁合成、蛋白质代谢、细胞骨架、氨基酸代谢、细胞响应和脂代谢等相关蛋白，其中大部分蛋白点表现为下调。几个差异明显的蛋白点分别为phospholipase D、phenylcoumaran benzylic ether reductase和s-adenosylmethionine synthase，暗示它们在绿色棉色素合成过程中起关键作用。为了进一步寻找绿色纤维中色素合成相关基因，本研究利用双向电泳技术研究了21DPA绿色棉纤维蛋白质组，从凝胶上挖取220个蛋白点进行MALDI TOF/TOF分析，成功鉴定出156个蛋白。根据蛋白的功能将这些蛋白分成12类，主要包括能量/碳水化合物代谢、细胞壁合成、氧化还原平衡和细胞骨架相关蛋白，反映了21DPA绿色棉纤维中的生理活动状态。根据差异蛋白质组策略和21DPA蛋白质组数据，在绿色纤维中没有发现明显的色素合成途径，类黄酮相关蛋白点在绿色纤维中无上调现象，表明绿色纤维中的色素物质与棕色纤维不同。2.3花色素还原酶是合成表儿茶素的关键酶之一，表儿茶素是原花色素的合成单元。利用比较蛋白质组学策略发现了一个在棕色棉纤维中明显上调的蛋白点，质谱鉴定为花色素还原酶。根据GenBank中该蛋白的cDNA序列克隆了GhANR基因，该基因包含1008bp核酸序列，编码336个氨基酸残基。实时荧光定量PCR分析显示GhANR在棕色纤维中的表达量高于白色棉。将GhANR连接至蛋白表达载体pET28a，转化大肠杆菌表达蛋白，酶活性测定表明GhANR蛋白能够催化矢车菊素转化为表儿茶素。