[目的]　　 观察移植小鼠对胚胎干细胞来源的胰岛样细胞团的移植排斥反应，探讨中药成分白藜芦醇(Resveratrol，Res)对胰岛样细胞团的移植排斥作用，以了解胚胎干细胞来源的组织、细胞的免疫原性以及机体对他们的移植排斥情况，探讨白藜芦醇是否具有抗移植排斥作用、是否适合作为胰岛移植的抗排异药物，以求找到一种高效低毒、适合作为抗器官移植、特别是胰岛移植排斥的新药，为胰岛移植的临床运用提供实验依据。　　 [方法]　　 1.小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)的扩增及向胰岛素分泌细胞定向分化的体外诱导：　　 1.1 ESC的扩增：将ESC接种于经丝裂霉素处理后的小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonic fibroblast，MEF)饲养层上，在含白血病抑制因子(LIF)的ESC培养基中培养3～4天后，按1:4比例传代扩增一次。。　　 1.2拟胚体(embryoid bodies，EBs)的形成：将培养3-4天的ESC消化后接种于细菌培养皿，在EBs培养基中悬浮培养4-5天，使ESC自发分化为EBs。　　 1.3 nestin阳性细胞(nestin positive cells，NPCs)的形成：将培养4-5天的EB转种于Ⅰ型胶原蛋白包被的培养瓶中，贴壁后更换为NPCs诱导培养基，连续诱导培养2-3天可形成NPCs。　　 1.4胰岛素分泌细胞(insulin-producing cells，IPCs)的形成：NPC形成后，更换为IPC诱导培养基，至第4d，培养液中添加浓度为10mmol/L的葡萄糖，24h后更换为含葡萄糖20mmol/L的培养基继续培养至IPC聚集为胰岛样细胞团(islet-like cell clusters，ICCs)。并用双硫腙(DTZ)染色进行鉴定。　　 2.移植动物准备：本实验选取6～8周龄昆明小鼠作为移植受体。将实验小鼠分为四个小组，每组3只。①CsA阳性对照组：按5mg/kg体重的剂量给予环孢霉素-A(CsA)0.5mL，腹腔注射；②Res实验组：按60mg/Kg体重的剂量给予白藜芦醇(Res)0.5mL，腹腔注射；③CsA+Res实验组：分别按5mg/kg体重的剂量给予环孢霉素-A(CsA)0.25mL和60mg/Kg体重的剂量给予白藜芦醇(Res)0.25mL，腹腔注射；④阴性对照组：不给任何药物处理，仅腹腔注射0.5mL磷酸盐缓冲液(PBS)。以上四组实验动物均于移植前3天开始每天腹腔注射一次，直至取材日终止给药。　　 3.ICCs移植及移植排斥反应情况的检测：将待移植的ICCs用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)标记，以便了解移植后的ICCs在小鼠体内的存活增殖情况。按平均每只小鼠200个细胞团的量，经注射移植到小鼠颈背部皮下脂肪组织，做好标记。移植后4天、8天及16天分批取移植有ICCs的脂肪组织，将每组标本一部分制作成冰冻切片，利用DAPI标记，采用激光共聚焦显微镜观察移植细胞的存活增殖情况；另一部分制作成普通病理切片后常规HE染色，观察宿主对移植的ICCs的免疫排斥情况；另一部分切片进行免疫组织化学染色，观察免疫排斥情况及Th1(IL-2、IFN-γ)和Th2(IL-6、IL-10)类细胞因子的表达情况，以了解Res的抗移植排斥效果，分析抗移植排斥的机理。　　 [结果]　　 1.ESC接种于饲养层MEF，经过3-4天的增值，ESC在有LIF存在时可形成致密的圆形或椭圆形集落。每4天传代一次。　　 2.在去除分化抑制因素后，ESC在悬浮状态培养4-5天后可自发形成球形细胞团，即拟胚体EBs。EBs在NPCs诱导培养基中贴壁培养3-4天，可形成上皮细胞样的nestin染色阳性细胞(NPCs)。NPC在IPC诱导培养基中做定向诱导培养6天后可形成为胰岛样细胞团(ICCs)。细胞团DTZ染色呈阳性，被染为深棕红色，说明细胞团中有胰岛素分泌细胞(IPCs)。　　 3.移植前将待移植的胰岛样细胞团(ICCs)用DAPI标记后经激光共聚焦显微镜观察，可见一团团与ICCs形态一致的蓝色荧光，说明ICCs标记成功；移植后8天取材的标本制成冰冻切片后在激光共聚焦显微镜下观察仍可见成团的蓝色荧光散在分布于脂肪团中，可判断为经DAPI标记后的ICCs所发出的蓝色荧光。　　 4.HE染色及免疫组织化学方法半定量分析结果比较显示：各组均有不同程度的炎症细胞浸润(中性粒细胞、淋巴细胞等)，说明胚胎干细胞来源的ICCs移植后存在明显的免疫排斥反应。药物处理组(CsA、Res、CsA+Res)炎症细胞浸润程度随时间的延长而降低。在大量炎症细胞浸润的脂肪组织中可见许多呈团块状生长的、类似胰岛素分泌细胞(IPCs)的小圆形细胞。细胞团块内似有新生血管生成。非药物处理组(对照组)只见许多炎症细胞浸润，未见似胰岛素分泌细胞(IPCs)的小圆形细胞。冰冻切片上夜未见DAPI标记细胞发出的蓝色荧光。说明移植细胞已经完全被排斥消失。细胞因子免疫组化检测发现，CsA组的IL-2、IFN-γ、IL-6及IL-10的阳性表达率分别为60.50％、74.50％、56.50％及11.50％，Res组分别为18.50％、31.50％、28.50％及21.50％，CsA+Res组分别为15.50％、23.50％、26.50％及45.00％。CsA组的IL-2、IFN-γ及IL-6的阳性表达率明显高于Res组和CsA+Res组，差异有统计学意义(P<0.05)；CsA+Res组的IL-10的阳性表达率明显高于CsA组，差异有统计学意义(P<0.05)；Res组与CsA组之间的差异无统计学意义(P=0.08)。　　 [结论]　　 1.本实验继续采用分阶段诱导方法，胚胎干细胞经过连续培养诱导，可以在18天的时间内获得具有胰岛素分泌功能的胰岛样细胞团(ICCs)。　　 2.通过移植前后在激光共聚焦显微镜都可以观察到经DAPI标记的细胞团所发出的蓝色荧光，说明实验组移植8天后仍有IPC存活。　　 3.白藜芦醇相比与环孢霉素-A更能降低IL-2、IFN-γ及IL-6的表达。白藜芦醇与环孢霉素-A联用不仅可以使以上三种细胞因子表达降低，还可以使IL-10的表达增加，说明白藜芦醇具有抗移植排斥作用，与环孢霉素-A联用时抗排异效果更好。