淋巴细胞活化基因3(Lymphocyte activation gene-3,LAG-3),在活化的T细胞和自然杀伤细胞有选择性表达。是一种对T细胞具有负调节作用的细胞表面分子蛋白。LAG-3作为一种可溶性分子,通过MHCⅡ类信号激活抗原提呈细胞,导致体内抗原特异性T细胞应答增加。最新研究显示FGL1/LAG-3是新的免疫抑制通路,通过抑制FGL LAG-3通路能够让T细胞重新恢复细胞毒性作用,从而限制肿瘤的生长。本试验通过定点突变方法,将LAG-3基因经过三轮PCR扩增得到LAG-3突变基因,将得到的LAG-3突变体基因与载体pCANTAB5E载体连接,将其转化入Ecoli TG1感受态细胞,构建LAG-3突变体库。利用FGL1蛋白包被固相载体,对LAG-3突变体库经过三轮的富集,phage ELISA法筛选到16个阳性克隆,选择其中一个阳性值最高的LAG-3M59进行了表达和鉴定。一:将LAG-3基因和LAG-3突变体基因(LAG-3M59)分别与载体pCANTAB5E连接,将其转化入E.coli TG1感受态细胞中,利用辅助噬菌体M13K07包装后,通过FGL1包被固相载体,采用ELISA法鉴定出LAG-3M59和LAG-3结合活性;二:将LAG-3基因和LAG-3M59基因分别与载体pFUSE-hlgG4-Fc2连接,转化到Trans-T1感受态细胞中,对其进行质粒提取,经去内毒素处理,转染至真核表达293细胞内,纯化,最终得到LAG-3M59蛋白和LAG-3蛋白。通过FGL1包被固相载体,采用ELISA法鉴定出LAG-3M59蛋白和LAG-3蛋白结合活性。试验研究结果如下:(1)LAG-3突变体库容量为5×106,经菌落鉴定突变体库转化效率为65%。(2)Phage ELISA筛选得到16株不同的阳性克隆,选取一株OD450nm吸光度值最高的克隆,命名为LAG-3M59,并对其进行鉴定。(3)Phage ELISA证明LAG-3M59与FGL1的结合活性比LAG-3高出2倍;真核表达LAG-3M59蛋白和LAG-3蛋白,通过ELISA证明LAG-3M59蛋白与FGL1结合活性比LAG-3蛋白高出3倍。