血管生成是在原有血管结构的基础上,由不同信号参与并刺激内皮细胞增殖、迁移、粘附,甚至是诱导血管周围细胞核胞外基质重构的多步骤过程。内皮细胞受体酪氨酸激酶是调节血管新生的重要因素,其代表性家族成员血管内皮生长因子(VEGF)和促血管生成素(angiopoietins)对血管新生的作用已得到证实并逐渐应用于临床。Eph是已知受体酪氨酸激酶家族(RTKs)中最大的亚家族,不同于其他RTKs成员同可溶性配体连接的特点,Eph通过细胞接触的形式同跨膜配体ephrin特异性结合。而配体ephrin主要发挥调节细胞迁移和粘附的作用。Eph/ephrin之间互为配-受体,形成双向信号,参与体内多种生理过程的调节,研究较为广泛的是其在神经系统中的作用。此外,还有不少研究指出,Eph/ephrin在血管新生过程发挥重要调节作用,尤其是EphB4和ephrinB2在动静脉上的特异性分布以及配-受体相互作用形成的双向信号,不仅调节胚胎期血管的发育,而且继续影响出生后血管新生。本课题组前期研究表明,血府逐瘀汤具有较好的促血管新生作用,且促血管新生作用与药物浓度和作用时间呈倒U型关系,提示该药具有促血管适度生长的作用,有别于VEGF等的一味促血管生成,避免出现血管过度生长。EphB4/ephrinB2在调节血管生成方面得到越来越多的肯定,而课题组应用基因芯片技术观察血府逐瘀汤对多种调控血管生成的因子的影响,检测发现配体ephrinB2呈上调表达。血府逐瘀胶囊在保持了血府逐瘀汤原方配伍的基础上,对剂型稍做改变,服用更加方面,而且可控性强,是的实验结果更客观可信。本实验用胶囊剂,目的在于探索血府逐瘀汤如何通过EphB4/ephrinB2信号通路促血管新生继而发挥适度调控的作用。目的通过观察血府逐瘀含药血清不同浓度(1.25%,2.5%,5%)下对体外成血管的影响,筛选出药物促血管新生的最佳作用浓度和时间；并在最佳作用条件下研究药物对EphB4/ephrinB2反向信号的调控。从细胞效应、转录水平、蛋白活性水平探讨血府逐瘀汤在微血管内皮细胞中对靶信号的作用机制,从而为血府逐瘀汤适度调节血管新生和临床应用提供实验支持。方法1含药血清的制备将健康成年男性志愿者随机分为药物干预组和空白血清组。药物组每日按要求服用二倍剂量的血府逐瘀汤,七天为一个周期,最后一次服药2小时后每人左静脉采集血液50ml,高速离心制备成含药血清,56℃水浴30分钟灭活补体；随后在无菌操作下用微孔滤膜进行过滤,分装后置于-20℃冰箱备用。空白血清组不做任何干预,血清制备收集方法同药物血清。2实验分组将常规培养的人微血管内皮细胞(HMEC-1)随机分为6组：血清含量分别为1.25%、2.5%、5%的空白血清干预组和药物血清干预组,每组血清均按比例溶于含5%胎牛血清(FBS)的MCDB-131培养基中。3采用基质胶检测药物对HMEC-1体外成血管能力的影响不同血清含量的药物组和空白组分别干预24h、48h和72h,应用In Vitro Angiogenesis Assay试剂盒,37℃温箱培养4小时后倒置显微镜高倍视野下随机计数管腔形成数量,比较相同血清含量下药物组和空白组间的差异,并挑选出最佳药物浓度和作用时间。4实时定量PCR技术检测EphB4/ephrinB2表达用Trizol法提取总RNA,取纯度合格的RNA适量,反转录成cDNA。根据Genbank发布的基因序列,应用Primer5软件设计靶基因和β-actin的引物。然后采用SYBR Green试剂盒检测不同时间点基因表达情况,用2-△△CT相对定量法进行评价。5免疫印迹法检测EphB4/ephrinB2的表达和磷酸化表达提取全细胞蛋白,用BCA法检测蛋白含量确定上样量。电泳对提取样品进行SDS-PAGE分离,湿转法将蛋白印迹到0.45um孔径的PVDF膜上。非磷酸化抗体用5%脱脂奶粉封闭,磷酸化抗体用5%牛血清白蛋白(BSA)封闭,之后放入稀释后的一抗中4℃孵育过夜,次日室温孵育二抗,并用化学发光试剂检测条带,比较表达差异。6EphB4/ephrinB2反向信号在血府逐瘀含药血清促血管适度生长中的作用在空白血清组加入EphB4/fc作为反向信号激活剂组,在含药血清中加入PP2作为反向信号抑制剂组。各组选择不同的作用时间点和作用浓度,并应用体外成血管技术分别比较激活剂组、抑制剂组与含药血清组成血管能力的差异,对反向信号在血府逐瘀汤促血管适度生长的作用进行细胞效应评价。结果1、血清含量的差异影响细胞活性,以48小时体外成血管为例,1.25%和2.5%空白血清的血管生成能力明显弱于5%空白血清(P<0.05),说明血清含量不同会对结果有影响；所以,本实验将同等血清含量的药物组及空白组进行对比,使得结果更为客观。2、体外成血管实验：2.5%含药血清干预48h促血管新生效果肯定(P<0.05),5%含药血清干预48h、72h后抑制血管新生的效果显著(P<0.01)。选定2.5%药物血清干预48h为促血管新生最佳条件。3、实时定量PCR：2.5%药物血清干预12小时之内的多个时间段,EphB4-mRNA和ephrinB2-mRNA表达均未见明显上调或下调。在随后的时间点,EphB4-mRNA于12h上调(P<0.05),24h下调(P<0.01),48h无明显变化；EphrinB2-mRNA的表达则是在12h、24h和48h多个时间点均无明显波动。4、Western Blot结果：2.5%药物血清干预24h, EphrinB2表达有显著提高(P<0.01),反向信号ephrinB2磷酸化活化水平在9小时有较明显升高(P<0.05)。5、在药物最佳作用条件下,分别激活和阻断EphB4/ephrinB2反向信号的传递,通过比较含药血清组与最佳浓度激活剂组体外成血管数目,证实药物干预组与反向信号激活剂组在促血管新生方面作用相当(P>0.05)。结论1、血府逐瘀汤能双向调控血管生长,不同药物浓度或是同一药物浓度不同作用时间对血管生成的影响不同,不仅能促血管新生,而且还能发挥抑制作用。2、血府逐瘀汤干预9h,反向通路受体活性状态EphrinB2磷酸化水平显著升高,结合反向信号刺激剂和抑制剂的实验结果,充分说明药物促血管新生作用与激活EphB4/ephrinB2反向信号通路有关。3、血府逐瘀汤仅在较短时间内激活反向通路,随即可能又激活正向信号表达；通过对双向信号的调控影响血管新生,而非一味促血管新生。4、血府逐瘀汤对EphB4、ephrinB2的转录及磷酸化水平影响明显早于细胞效应的表现,说明EphB4、ephrinB2是上游信号,经一系列的传递才能表现出最终效应,提示该通路是药物发挥调控作用的早期关键信号。