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胰岛素基因治疗是利用分子生物学技术,将体外构建的能够在体内表达胰岛素的人造基因转移至在糖尿病病人体内特定的细胞内,使之长期保留并表达胰岛素的一种实验性治疗手段。如何安全、持续、稳定地将胰岛素基因转移至活体细胞内并能合理地按需调控其表达等是胰岛素基因治疗仍没能解决的核心技术问题。骨骼肌被视为基因治疗中目的基因表达的良好载体,有如下优点:①体块巨大、部位表浅、容易操作;②血运丰富、蛋白质产生后能迅速入血;③作为永久性细胞没有分裂能力,细胞数目不变,使外源基因易于在细胞核内长期保留、其数目不会发生增减;④细胞间有融合性、外源基因较易向周围的肌肉细胞内扩散、转移效率高;⑤质粒作为基因转移的载体具有不含病毒、安全性好,构建容易、能够大量制备,治疗效果不受重复注射次数的影响等优点。但是,就胰岛素基因治疗而言,肌肉缺乏血糖调控的基因启动子,胰岛素持续分泌可能会引起致命的低血糖。重组四环素耐药基因操纵子系统能够在真核细胞表达,通过这一系统人们能够调控外源基因在体内的表达。因此,利用四环素操纵子表达系统质粒调控骨骼肌胰岛素基因的表达应该是可行的。目的 构建强力霉素调控的胰岛素基因表达载体,验证其在成肌细胞内受强力霉素调控后的表达情况;研究该质粒在骨骼肌注射后对链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病小鼠血糖的控制作用及电穿孔对该质粒肌内注射后转导效率的影响,探讨通过调控该质粒体内表达来调节血糖水平的可行性。方法 1.强力霉素调控的胰岛素基因表达质粒的构建及其在体外成肌细胞内的表达调控(1)构建ptet-mINS 分别用BamHI和ClaI酶切pUHG102-8质粒和pINS-ABC质粒,将胰岛素原基因片段定向克隆到pUHG102-8质粒的四环素耐药基因启动子下游,得到ptet-mINS质粒,并用BamHI和ClaI酶切鉴定插入序列的准确性。 <WP=5>(2)构建prTA-tet4-mINS 用XhoI和HindIII酶切prtTA2-1质粒,将得到的PhCMV-rtTA2-1/poly(A)片段插入到经XhoI酶切的ptet-mINS质粒,得到prTA-tet4-mINS质粒。(3)建成prTA-tet4-rhINS 用ScaI和BamHI酶切pLNCX质粒,将所得到的无功能5’LTR-(+-Neor片段插入到经XhoI酶切的prTA-tet4-mINS上得到最终的prTA-tet4-rhINS质粒。直接测序其正确无误。(4)质粒导入成肌细胞系 用脂质体转移法将prTA-tet4-rhINS和pLNCX(一种含有新霉素抗性基因,但不含胰岛素基因的逆转录病毒基因克隆、表达质粒)导入同一成肌细胞系(C2C12)细胞内。经氨基糖苷(G418,一种新霉素类似物)筛选后,以不同浓度(0(g/ml、2(g/ml及10(g/ml)的强力霉素(Dox)诱导成活细胞,检测诱导后第1、3、5、7天及撤药后第1,3及5天培养基和细胞提取物的胰岛素(原)水平。留取第5天培养的细胞进行胰岛素原mRNA检测。用放射免疫分析(RIA)测定胰岛素(原)水平。C2C12细胞内人胰岛素原mRNA用反转录-多聚酶链反应技术(RT-PCR)检测。2.骨骼肌注射的prTA-tet4-rhINS对不同种系STZ糖尿病小鼠血糖的作用①用大肠杆菌扩增、碱裂解法提取及聚乙二醇法纯化质粒prTA-tet4-rhINS和pLNCX;②腹腔内注射STZ(150mg/kg)制备Balb/C和昆明种小鼠糖尿病模型(血糖≥16.7 mmol/L,持续2周以上);③经皮向小鼠双侧后腿骨骼肌内各注射prTA-tet4-rhINS质粒150μg,共300μg(治疗组),注射pLNCX质粒者为对照组,同时使小鼠分别饮服浓度为0.5g/L和2g/L的Dox水,尾尖取血,测定每日上午8时随机血糖(葡萄糖氧化酶试纸法),并称量小鼠体重;④血糖稳定下降的第6天,断头处死部分小鼠,留取全血、注射部位的骨骼肌及肝脏组织,测定血清人胰岛素(RIA)和C肽(免疫放射定量分析,IRMA)水平以及注射部位小鼠骨骼肌人胰岛素原mRNA(RT-PCR)。3.电穿孔技术prTA-tet4-rhINS肌肉转导和降血糖的增强作用①制备昆明小鼠糖尿病模型(方法同前)。②分单纯肌肉注射prTA-tet4-rhINS组(单纯注射组,48只)、肌肉注射prTA-tet4-rhINS后电穿孔增强组(电穿孔组,42只)和肌肉注射pLNCX后电穿孔增强组(对照组,35只),注射质粒剂量相同(肌肉注射方法同前),同时饮服浓度为2g/L的Dox水。监测鼠尾末梢血糖(方法同前)和小鼠体重。③于血糖稳定下降的第14天,对部分小鼠摘眼球取血并留取肝脏、注射部位肌肉。测定血清中人真胰岛素(ELISA)水平及小鼠肌肉组织中人胰岛素原基因mRNA(RT-PCR)。④观察部分对照组小鼠、电穿孔组血糖控制稳定的小鼠及正常小鼠,在饮服进而撤除Dox水(2g/L)过程中及在持续饮服Dox水(2g/L)的情况下,空腹24小时内其血糖水平的变化情况。 <WP=6>结果1.强力霉素调控的胰岛素基因表达质粒的构建及其在体外成肌细胞内的表达调控①直接测序结果显示prTA-tet4-rhINS质粒的胰岛素基因片段插入方向及核酸顺序与预计的完全一致;②RT-PCR结果显示此质粒能在C2C12细胞内表达;③细胞培养液中的胰岛素水平在加药24小时后开始增加,至第7天接近达平台,撤药后迅速下降,撤药后第5天降至基础水平。④培养基内加入不同浓度强力霉素,其胰岛素产量明显不同,10μg/ml时培养基内的胰岛素水平(23.32(1.47mIU/L)明显较2μg/ml时(13.29(1.40mIU/L)高(p<0.05)。细胞内和培养基中的胰岛素水平无明显差异(p>0.05),细胞内胰岛素水平在Dox为10μg/ml时和2μg/ml时分别为23.8