论文部分内容阅读
Wolbachia是一种革兰氏阴性菌,普遍存在于节肢动物体内,通过母系遗传调控宿主生殖方面的变化,其中细胞质不亲和(cytoplasmic incompatibility,CI)是最常见的研究最多的表型,除此以外,还有孤雌生殖、雌性化和杀雄等生殖方面的变化。在果蝇中,感染Wolbachia的雄性果蝇与未感染或者感染不同Wolbachia品系的雌性果蝇进行交配时,后代胚胎成活率降低或仅有少量后代的现象,叫做细胞质不亲和(CI)。细胞质不亲和导致受精卵在第一次有丝分裂时雄性原核发育速度低于雌性原核发育速度,在分裂时形成染色质间桥,第一次有丝分裂失败,导致胚胎死亡。尽管有研究表明,Wolbachia可能对宿主的精子产生了修饰作用,但有关Wolbachia诱导细胞质不亲和的分子机制还不是很清楚。本课题组前期通过microarry技术检测了未感染和感染Wolbachia的三龄幼虫精巢中基因表达情况,鉴定到许多差异表达(上调和下调)的基因,其中包括ocnus(ocn)。本研究首先通过RT-PCR (qRT-PCR)的方法,进一步检测了Wolbachia的感染果蝇精巢中ocn表达的影响,结果显示,Wolbachia感染导致1日龄果蝇精巢中ocn表达量极显著下调(p<0.01),说明ocn可能与雄性果蝇的繁殖有关。已有研究认为,ocn在精巢中特异表达,暗示ocn可能对雄性繁殖起重要作用。有关ocn在果蝇繁殖过程中的具体作用还未见报道。为了进一步研究ocnus的功能,我们采用UAS-RNAi/Ga14系统,研究ocn敲降对果蝇繁殖的影响。我们分别用NosGa14和BamGa14驱动ocn在生殖腺和精巢中特异敲降,qRT-PCR检测发现,无论是用NosGa14还是BamGa14驱动,都使得1日龄敲降雄蝇体内ocn的表达量与对照组相比有极显著下调(p<0.01),说明敲降效果好。为了研究ocn基因敲降对雄果蝇繁殖的影响,我们用两种方法敲降的1日龄雄果蝇(NosGa14; ocn-hp和BamGa14; ocn-hp)与正常处女蝇交配,统计子代的胚胎孵化率。结果显示,两种方法敲降的雄果蝇的子代胚胎孵化率极显著低于对照组(NosGa14; W-和BamGal4;W-)(p<0.01),说明ocn在精巢中敲降严重损伤了雄性果蝇的繁殖力。为了研究ocn在精巢中对精子发生的影响,我们对实验组NosGa14; ocn-hp和BamGal4; ocn-hp与对照组的一日龄雄蝇精巢进行DAPI染色,荧光显微镜观察发现,与对照组相比,精巢明显变小,精巢顶部变得狭窄,生殖干细胞分散,精巢中极少有精子发生过程中的包囊,也有极少的精子束,储精囊中极少有成熟的精子。因此,ocn敲降严重影响精巢的发育和精子发生过程。这可能是导致子代胚胎孵化率极显著下降的原因之一。由于ocn在雄性果蝇中表达量特别高,为了研究其是否对雄性果蝇的求偶交配行为产生影响,我们对敲降雄蝇的交配活力进行检测,结果表明,在实验的30min内,NosGal4;ocn-hp和BamGal4;ocn-hp雄果蝇与正常雌果蝇(Dmel wMel T)发生交配的比率与对照组相比有显著减少,且交配的持续时间也有显著缩短,说明ocn敲降也影响雄蝇交配活力。由于嗅觉、运动能力等都会对交配活力产生影响,为研究ocn敲降组中果蝇交配活力下降到底是由运动能力减弱引起,还是由嗅觉反应能力降低引起的,我们先采用食物陷阱的方法,对敲降雄蝇的嗅觉反应能力进行检测,捕获实验显示,与对照组相比,ocn敲降果蝇对食物陷阱反应能力都有极显著下降,相同的时间内被捕获的比例极显著低于对照组(p<0.01)。为明确ocn敲降的果蝇被食物陷阱捕获比例降低是否与果蝇本身的运动能力下降有关,我们又采用空陷阱和雌蝇陷阱分别对敲降雄蝇的活动能力和对雌性果蝇分泌的性信息素的识别能力进行检测,结果发现NosGal4;ocn-hp 10日龄雄性果蝇的活动能力和对雌蝇性信息素的识别能力与对照组相比,都显著降低。最后我们又检测了ocn敲降的果蝇中相关基因(嗅觉相关基因：PBP1、PBP2、PBP3、orco;运动相关基因：mlc、fln、myo61F、how、mef2、 actn、Imd)的表达水平。结果发现,仅有运动相关基因mlc2的表达量在ocn敲降雄蝇体内显著降低(p<0.05),下调到原来的0.35倍。由于已有研究表明,在果蝇中,mlc2的突变严重破坏果蝇的飞行机制和“求爱歌”的频率,因此,我们推测,ocn敲降引起的雄性果蝇交配活力的降低可能是由mlc2下调后果蝇自身运动能力减弱导致的。我们也发现,BamGal4;ocn-hp3-4日龄处女蝇雌蝇与Dmel wMel T1日龄雄蝇交配后,雌蝇产卵量明显减少(p<0.05)。所以,ocn的敲降也对雌性果蝇的繁殖力有影响。综上所述,ocn不仅在果蝇精子发生过程中起重要作用,而且对果蝇的运动能力(交配行为)也有很大的影响。