恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，尽管针对肿瘤治疗的手段已有较大的改善和提高，但仍不能明显提高对肿瘤的抑制效率和增加患者的生存几率。传统的治疗手段有放射疗法和化学疗法，但二者的治疗存在很大风险，治疗过程还会给患者带来痛苦且存在副作用。手术切除肿瘤法，虽然可以去除病灶，但依然有肿瘤扩散和复发的可能性。新城疫病毒（Newcastledisease virus，NDV）为不分节段的单股负链RNA病毒，隶属于副粘病毒科禽副粘病毒属。上世纪六十年代，研究发现NDV可用于治疗人类肿瘤，其可在肿瘤细胞中进行特异性复制，同时对正常细胞并无明显的影响。反向遗传操作技术已经成熟建立，目前应用十分广泛。研究者可以利用该技术对病毒基因组加以改造，使野生型毒株的抗肿瘤效果得以提升。本研究将自杀基因CD插入到重组新城疫病毒的基因组中，并通过反向遗传操作技术拯救病毒，协同5氟胞嘧啶（5-flucytosine，5-FC），增加治疗的靶向性，达到抑制肿瘤的目的。CD(Cytosine deaminase)为自杀基因家族的成员之一，它存在于大肠杆菌或酵母菌等基因组当中，在哺乳动物体内并不存在。CD可将相应的无毒前导药物（prodrug）5-FC转化为具有毒性的抗肿瘤药物5氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU），后者可引起肿瘤细胞死亡。通过克隆技术获得大肠杆菌E.coli JM109菌株全基因组中的CD基因，构建成真核表达质粒pEE12.4-CD-IRES-EGFP（pEE12.4IE-CD）并转染HepG2细胞，为验证CD表达产物的体外生物学活性，以不同浓度的5-FC孵育单层细胞，采用MTT法检测细胞的死亡率，结果表明CD转化5-FC效果良好，HepG2细胞生长受到显著抑制。携带自杀基因进入细胞的常用载体有慢病毒和腺病毒，这两种载本身并不具备杀伤肿瘤的作用。而利用自身具有抗肿瘤能力的新城疫病毒作为载体，携带CD基因进入肿瘤细胞，可以增强二者的抗肿瘤能力。本研究首次利用反向遗传操作技术在重组新城疫病毒弱毒株LaSota rClone30基因组的F基因和HN基因之间插入了CD基因的开放阅读框，构建带有CD基因的NDV全长cDNA转录质粒pBrClone30-CD。将该转录质粒与表达核衣壳蛋白、磷酸化蛋白以及大聚合酶蛋白的辅助质粒，共同转染能够稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞，拯救后获得的重组新城疫病毒于SPF鸡胚中进行增殖，并收集尿囊液进行血凝和血凝抑制实验，重组病毒命名为重组新城疫病毒rClone30-CD株。通过在鸡胚中连续传代8代，确定插入CD基因的新城疫病毒可以稳定增殖。说明CD基因片段的插入并未对病毒复制能力造成影响。在体外实验中，采用MTT法检测不同MOI的重组新城疫病毒对HepG2细胞的抑制作用。结果表明，重组病毒可以有效地抑制HepG2细胞的生长，并呈现剂量依赖性。在较高的MOI条件下，rClone30-CD/5-FC抑制效果明显大于rClone30-CD，说明重组新城疫病毒与前导药物5-FC协同效果显著。在体内实验中，我们首先对5-FC的半数致死量（LD50）和最大安全剂量进行测定，保证实验小鼠的安全和药物注射剂量的最优化。建立昆明小鼠H22腹股沟皮下荷瘤模型，通过瘤内注射重组新城疫病毒，并采用瘤内或尾静脉两种不同的方式注射5-FC，达到协同治疗肿瘤的目的。实验结果表明，与rClone30-CD治疗组相比，rClone30-CD/5-FC抑制肿瘤生长的效果明显，重组新城疫病毒与前导药物5-FC协同效果显著，而且可以提高小鼠的存活率。两种不同给药方法所得到结果一致，说明瘤内注射或尾静脉注射5-FC，均能达到良好的抑制肿瘤目的。对小鼠血样中5-FU的含量进行测定，在rClone30-CD/5-FC组的样本中检测到5-FU的存在，5-FC组未检出5-FU。结果表明，插入到NDV中的外源CD基因具有生物学活性，可将5-FC转化为5-FU，并且由于5-FU的存在，使得rClone30-CD/5-FC的抗肿瘤作用显著提升。综上所述，本研究应用反向遗传操作技术，成功拯救重组NDV rClone30-CD，体外实验证实重组NDV rClone30-CD/5-FC能有效的杀伤HepG2细胞。在体内试验中，采用两种不同方法进行5-FC给药，rClone30-CD/5-FC均能达到良好的抑制肿瘤细胞效果，并且可以延长实验小鼠的存活时间。本研究为提高NDV弱毒株治疗肿瘤效果以及为重组新城疫病毒作为自杀基因的载体，应用于恶性肿瘤的靶向治疗奠定良好的基础。