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白血病是世界范围内常见血液系统的恶性克隆性疾病(HM),尤其是在青少年中的发病率和致死率较高,目前大部分仍无法治愈,临床化疗放疗或者药物诱导并不能完全使患者康复痊愈率低。白血病是由于造血细胞的某一系列或者是某一白细胞前体细胞失去分化成熟能力,分化成熟受到阻碍,正常凋亡途径发生障碍,以至于出现了大量的异常分化的细胞,正常成熟的血液细胞减少,一系列临床症状出现,诱发白血病。因此,抑制白血病细胞增殖、促进细胞的分化与凋亡是治疗白血病的有效途径。目前,用于血液恶性肿瘤的治疗有着非常多的治疗方案,如前沿技术干细胞治疗、诱导分化药物的应用、免疫生物学疗法等等。但是这些治疗方法在发挥抗白血病的同时也存在诸多的不足之处:临床上的放疗和化疗虽然能使白血病缓解和暂时控制,但它缺乏特异性,在杀伤白血病细胞的同时,正常细胞也受到损伤。骨髓移植得到一定范围的肯定和推广,在白血病的治疗中起到很大的作用,但容易出现异体排斥和残留白血病细胞复发。对与血液恶性肿瘤的发生有关的某些关键基因的研究,已经成为根治血液肿瘤的着力点。肿瘤转移抑制基因nm23-H1是Steeg等用消减杂交法分离鉴定出来的,该基因是nm23基因家族中的成员之一,其编码的蛋白产物是核苷二磷酸激酶(NDPK),是一种酶管家,其主要功能是通过乒乓机理把二磷酸核苷(NDP)转变成除了ATP以外的三磷酸核苷(NTP),用来维持体内NTP的量;另外,nm23-H1基因可作为蛋白质激酶参与其他生化途径,和与肿瘤转移抑制、细胞的凋亡、扩增、DNA突变、转录激活等紧密相关。因此,基因nm23-H1在许多种恶性肿瘤疾病中的作用是抑制肿瘤细胞的转移和增殖,在某一些恶性肿瘤中,基因nm23-H1表达水平高,其癌组织的转移潜能就低;基因nm23-H1表达水平低,其癌组织的转移潜能大,病情严重不易治愈;而在白血病和淋巴瘤等恶性血液病中,nm23-H1基因表达的临床意义与之相反,nm23-H1基因表达高的病人白血病细胞增殖快细胞分化成熟受阻,不利于患者治愈和康复;nm23-H1基因表达低的病人白血病细胞分化阻力小利于患者治愈和康复;因此nm23-H1基因的高表达可作为血液恶性肿瘤预后不良的指标之一。nm23-H1基因与调控肿瘤转移和造血细胞的增殖分化活动存在密切关联,研究表明nm23-H1/NDPK-A在造血祖细胞向成熟血液细胞发育的过程中有着关键作用。nm23-H1基因作为分化抑制因子能抑制多种白血病细胞的分化并且不依赖其激酶活性。c-Myc基因是参于白血病增殖分化有关的原癌基因和重要的转录因子,大量的研究证实c-Myc基因表达的调控主要是在转录水平上进行,c-Myc基因的蛋白定位在自身细胞核内,调节RNA转录是通过与增强子结合完成的。原癌基因c-Myc在调节造血系统的动态平衡和肿瘤发生发展中起非常关键的作用,关于判断细胞分化程度它也是一个重要的参考指标。细胞因子和白血病细胞的增殖存在着密切关系,通过自分泌和旁分泌的作用而影响细胞的增殖和分化。用ATRA治疗后APL患者血清中的细胞因子,结果显示血清中的G-CSF与总白细胞数成正相关关系。在以上背景材料基础上,我们设计了以下相关实验,探讨在白血病细胞分化过程中nm23-H1,c-Myc,G-CSF的作用机制及相互关系,为临床治疗提供理论依据和治疗靶点。本研究以急性早幼粒HL-60细胞和急性白血病单核THP-1细胞为研究对象,分别用ATRA和PMA诱导,探讨nm23-H1基因下调对白血病细胞分化的影响,以及nm23-H1与c-Myc,G-CSF之间是否存在相互作用,为靶向nm23-H1基因治疗白血病及运用RNA干扰技术治疗白血病提供理论依据。CCK-8法选取最佳ATRA、PMA药物诱导浓度,建立全反式维甲酸(ATRA)诱导的HL-60细胞模型,佛波酯(PMA)诱导的THP-1细胞模型,诱导的0h和72h后,流式细胞仪检测CD11b,CD14的表达变化,并用瑞士-吉姆萨染色观察细胞形态学验证模型建立是否成功。诱导的0h、10h、24h、48h、72h后分别在转录和翻译水平检测nm23-H1与c-Myc,G-CSF基因的表达变化。采用酶联免疫吸附法测定ATRA诱导HL-60细胞分化过程中培养上清里G-CSF水平的变化。统计学分析试用spss13.0软件。不同浓度的ATRA均能抑制HL-60细胞增殖并促进其分化,通过计算ATRA的半数抑制率为1μmol/L,药物诱导后和对照组比较,Wright-Gimesa染色后显示细胞核明显缩小,核仁消失,其胞浆增多,核浆比降低,核有明显凹陷及分叶,杆状核和分叶核现象增多,增殖受到明显抑制。酶联免疫吸附法测定ATRA诱导HL-60细胞分化过程中培养上清里G-CSF水平显著升高(P<0.05)。通过计算得出PMA的半数抑制浓度(IC50)大约为30ng/ml;悬浮生长的THP-1细胞经药物诱导后,呈现出贴壁生长的状态,有的呈聚集生长现象,药物刺激后的细胞体积与对照组相比增大,细胞胞质也显著增多,核质比降低,明显地细胞褶皱突起增多,染色后胞质颜色变浅,向单核-巨噬细胞方向分化。实验结果表明,无论从翻译水平上还是从蛋白水平上nm23-H1,c-Myc基因表达都降低,两者呈正相关;G-CSF表达升高,和nm23-H1表达相反,呈负相关关系。在体外细胞实验中,HL-60细胞经ATRA药物诱导后,细胞呈现向成熟粒细胞分化的趋势;PMA可以抑制白血病细胞系THP-1细胞的增殖,细胞呈现向单核-巨噬细胞系分化的趋势;在此过程中,在两种诱导分化剂处理白血病细胞系向不同方向分化的过程中,nm23-H1基因表达随着白血病细胞向成熟血液细胞分化的不同时间点有着不同程度的下调。这说明nm23-H1基因在白血病细胞分化中起到关键的调控作用,对白血病细胞系的分析研究证实,在诱导白血病细胞分化过程中,nm23-H1基因下调后,c-Myc基因的表达随之相应下调,提示在白血病细胞的分化过程中nm23-Hl基因可能通过与c-Myc基因相互影响发挥作用。nm23-H1基因下调发挥诱导分化作用还可能是通过提高G-CSF基因的表达而实现。推测,nm23-H1的高表达可作为恶性血液系统肿瘤预后不良的指标之一,其与c-Myc和G-CSF存在相关性,提示nm23-H1基因有可能成为治疗白血病和淋巴瘤的新靶点。