【背景】胃癌发生和胃癌多药耐药都是涉及到多种因素多个步骤的复杂的生物学过程。尽管二者归属不同的病理过程,但在分子网络调控中可能存在交叉点。目前在胃癌已发现多种基因和蛋白,但被公认的有确切相关者屈指可数,且相互之间缺乏内在的联系。ZNRD1(zinc ribbon domain-containing 1 protein)是2000年发现的一种锌带蛋白,可能通过调节转录起始位点的选择、RNA合成的延长和终止在转录中发挥重要调节作用。作为转录相关蛋白,ZNRD1可能参与对多种生理病理过程的调控。ZNRD1基因定位于人的HLA位点,具有潜在的MHC基因治疗的作用。本研究所率先对ZNRD1的功能进行了研究,已证实ZNRD1可能参与对胃癌多药耐药的调控。本研究进一步探索了ZNRD1在胃癌发生和胃癌多药耐药中的调节作用及其分子机制,不但T丰富T了ZNRD1的生物学功能研究,还为探讨新的肿瘤基因治疗方法奠定了理论基础。【目的】探讨ZNRD1在胃癌发生和胃癌多药耐药中的调节作用及其分子机制。【方法】1)应用杂交瘤技术制备ZNRD1的首个单克隆抗体;2)利用RT-PCR、Western blot和免疫组化技术检测ZNRD1在胃癌组织、胃炎组织、正常胃上皮组织、胃癌细胞和正常胃组织上皮细胞中的表达；3）利用分子克隆的方法构建ZNRD1的小干扰RNA载体，并进行测序鉴定；4）利用脂质体转染法将ZNRD1的真核表达载体及其空载体转染胃癌细胞（AGS、SGC7901、MKN28）和小鼠成纤维细胞（NIH3T3），G418筛选获得稳定的克隆后进行鉴定；5）利用脂质体转染法将ZNRD1的小干扰RNA载体及其空载体转染药敏胃癌细胞（SGC7901）、正常胃组织上皮细胞（GES-1）、对长春新碱耐药的胃癌细胞（SGC7901/VCR）、药敏白血病细胞（HL-60）、对长春新碱耐药的白血病细胞（HL-60/VCR），G418筛选获得稳定的克隆后进行鉴定；6）利用MTT实验检测ZNRD1高/低表达对细胞（AGS、SGC7901、MKN28、NIH3T3、GES-1）生长的影响；7）通过软琼脂克隆形成实验检测上调ZNRD1对胃癌细胞（AGS、MKN28）克隆形成能力的影响T；T8）通过裸鼠成瘤实验检测上调ZNRD1对胃癌细胞（AGS、MKN28）体内成瘤性的影响T；9）T通过T流式细胞仪分析TZNRD1高/低表达对细胞（AGS、MKN28、NIH3T3、GES-1）的T细胞周期的影响T；T10）T通过T流式细胞仪分析T上调ZNRD1对细胞（AGS、MKN28、NIH3T3）的T细胞凋亡的影响T；11）通过MTT实验检测ZNRD1高/低表达对肿瘤细胞（SGC7901、SGC7901/VCR、HL-60、HL-60/VCR）体外药物敏感性的影响；T12）T通过肾包膜下移植法T检测TZNRD1高/低表达对肿瘤细胞（SGC7901、SGC7901/VCR）体内药物敏感性的影响；13）通过T流式细胞仪分析TZNRD1高/低表达对肿瘤细胞（SGC7901、SGC7901/VCR、HL-60、HL-60/VCR）内阿霉素蓄积和泵出的影响；14）通过透射电镜T检测上调TZNRD1对SGC7901细胞凋亡敏感性的影响；15）通过T流式细胞仪和DNA梯度试验检测TZNRD1高/低表达对肿瘤细胞（SGC7901、SGC7901/VCR、HL-60）凋亡敏感性的影响；16）通过基因芯片检测ZNRD1高/低表达对胃癌细胞内基因表达谱的影响；17）利用RT-PCR和Western blot对基因芯片的结果进行鉴定；18）利用报告基因实验检测ZNRD1对细胞周期相关分子Cyclin D1的启动子活性的调节作用；19）利用报告基因实验检测ZNRD1高/低表达对肿瘤耐药相关分子MDR1的启动子活性的调节作用；20）利用激酶试验检测ZNRD1对Tcyclin E-CDK2激酶活力的影响T；21）利用反义核酸技术抑制细胞周期相关分子Tp21的表达；T利用T流式细胞仪技术检测抑制p21对TZNRD1介导的细胞周期阻滞的影响；22）利用反义核酸技术抑制细胞周期相关分子Tp27的表达；T利用T流式细胞仪技术检测抑制p27对TZNRD1介导的细胞周期阻滞的影响；23）利用脂质体转染技术上调信号转导分子Skp2T的表达；T利用T流式细胞仪技术检测T上调Skp2T对TZNRD1介导的细胞周期阻滞的影响；24）利用Western blot检测ZNRD1对Tp27和Skp2的蛋白稳定性的调节作用；T25）利用微血管密度（MVD）实验T检测TZNRD1对胃癌细胞（AGS、MKN28）裸鼠移植瘤微血管形成的影响；26）利用ELISA试验检测ZNRD1对胃癌细胞（AGS、MKN28）培养上清和移植瘤匀浆中VEGFB165B含量的影响；27）利用脂质体转染法、MTT实验、肾包膜下移植法、T流式细胞仪和DNA梯度试验检测新耐药相关分子TDARPP-32对胃癌细胞（SGC7901、SGC7901/VCR、对阿霉素耐药的胃癌细胞SGC7901/ADR）多药耐药表型的影响；利用脂质体转染法和MTT实验检测T上/下调TZNRD1对DARPP-32介导的胃癌多药耐药的调控作用。【结果】1）成功制备了可特异识别野生型ZNRD1蛋白的鼠抗人单克隆抗体；2）ZNRD1在胃癌细胞中的表达比正常胃组织上皮细胞明显降低，在胃癌组织中的表达比癌旁组织明显降低；ZNRD1在正常胃组织、胃炎组织和胃癌组织中的表达率分别是63％、81％和9％，ZNRD1在胃炎组织中的表达率显著高于正常胃组织，在正常胃组织中的表达率显著高于胃癌组织；3）成功构建了ZNRD1的小干扰RNA载体；4）成功建立了稳定高表达ZNRD1的细胞模型及其对照模型；5）成功建立了稳定低表达ZNRD1的细胞模型及其对照模型；6）上调ZNRD1可导致胃癌细胞和小鼠成纤维细胞的生长速度明显减慢；下调ZNRD1可导致正常胃组织上皮细胞的增殖速度明显加快，还可导致胃癌细胞出现增殖速度加快的趋势；7）上调ZNRD1可显著抑制胃癌细胞的克隆形成能力；8）上调ZNRD1可显著抑制胃癌细胞的体内成瘤性；9）上调ZNRD1可导致细胞出现G1期阻滞；下调ZNRD1可导致正常胃组织上皮细胞的G1期比例减少，S期比例增多；10）上调ZNRD1不能导致明显的细胞凋亡；11）下调ZNRD1可显著增强肿瘤细胞的体外药物敏感性，上调ZNRD1可显著降低肿瘤细胞的体外药物敏感性；12）上调ZNRD1显著降低了胃癌细胞的体内药物敏感性，下调ZNRD1显著增强了胃癌细胞的体内药物敏感性；13）下调ZNRD1可显著增强肿瘤细胞内的药物蓄积浓度，而减少药物的泵出；上调ZNRD1可显著降低肿瘤细胞内的药物蓄积浓度，而增加药物的泵出；14）透射电镜T试验的T结果表明，上调ZNRD1可显著增强胃癌细胞对药物的凋亡敏感性；15）T流式细胞仪和DNA梯度试验的T结果表明，上调ZNRD1可显著增强肿瘤细胞对药物的凋亡敏感性，下调ZNRD1可显著抑制胃癌细胞对药物的凋亡敏感性；16）ZNRD1可能调节263种基因的变化；17）ZNRD1可能显著下调cyclin D1、CDK4、DARPP-32和VEGFB165B的表达，而上调p21、p27、低磷酸化形式pRB、P-gp、IMPDH2、Bcl-2的表达；18）上调ZNRD1可显著抑制胃癌细胞中Cyclin D1的启动子活性；19）上调ZNRD1可显著增强胃癌细胞中MDR1的启动子活性；下调ZNRD1可显著抑制胃癌细胞中MDR1的启动子活性；20）ZNRD1可显著抑制胃癌细胞内TcyclinE-CDK2的激酶活力T；21）抑制Tp21的表达对TZNRD1介导的细胞周期阻滞T没有明显的逆转作用；T22）抑制Tp27的表达可显著逆转胃癌细胞T内ZNRD1介导的细胞周期阻滞T；T23）建立了稳定的Skp2高表达的胃癌细胞模型；上调Skp2的T表达可显著逆转TZNRD1介导的细胞周期阻滞；24）上调ZNRD1可显著增强Tp27的蛋白稳定性，而显著抑制TSkp2的T蛋白稳定性；T25）上调ZNRD1可显著抑制胃癌细胞裸鼠移植瘤的微血管形成；26）上调ZNRD1可显著抑制胃癌细胞培养上清和移植瘤匀浆中VEGFB165B的含量；27）成功建立了稳定高/低表达DARPP-32的胃癌细胞亚系；上调DARPP-32显著增强了胃癌细胞的药物蓄积浓度，抑制了药物的泵出；同时显著抑制了胃癌细胞的抗凋亡能力；抑制TZNRD1的表达可显著逆转TDARPP-32介导的胃癌多药耐药T，上调ZNRD1的表达可显著促进TDARPP-32介导的胃癌多药耐药。【结论】1）ZNRD1在正常胃组织中的表达显著高于胃癌组织，在正常胃组织上皮细胞中的表达显著高于胃癌细胞；上调ZNRD1可以一定程度地逆转胃癌细胞的恶性T表型，T导致胃癌细胞的生长速度明显减慢，并出现G1期阻滞；下调ZNRD1可以导致正常胃组织上皮细胞增殖速度明显加快；T提示TZNRD1基因可能是一个新的候选抑癌基因，在T肿瘤基因治疗中T具T有较好的临床应用前景。T2）ZNRD1可能通过调控细胞周期和肿瘤血管生成参与胃癌的发生。ZNRD1调控细胞周期的分子机制是：通过抑制Cyclin D1的启动子活性而下调Cyclin D1的表达，进而抑制cyclin D/CDK4复合物和Tp21T、Tp27的结合，增加p21T和Tp27的表达，T抑制cyclin E/CDK2复合物的活性。cyclin E/CDK2复合物活性的降低，导致低磷酸化形式pRb的表达增加，进而抑制E2F等转录因子的释放，发挥细胞生长抑制的调控作用。ZNRD1还可能通过增强TSkp2的不稳定性抑制Skp2的表达，进而T增强Tp27的蛋白稳定性，上调p27的表达T。ZNRD1调控肿瘤血管生成的分子机制是：ZNRD1可能通过抑制VEGFB165B的表达减少胃癌细胞裸鼠移植瘤的微血管形成，进而抑制胃癌细胞在裸鼠体内的生长。3）下调ZNRD1可以显著逆转肿瘤细胞的耐药表型；上调ZNRD1可以显著降低肿瘤细胞的药物敏感性；提示ZNRD1可能在肿瘤多药耐药中扮演重要角色T。T4）ZNRD1调控胃癌多药耐药的分子机制是：ZNRD1可能通过调节P-gp的表达影响细胞内药物蓄积和泵出，通过调控Bcl-2的表达影响细胞凋亡，通过调节IMPDH2的表达影响DNA合成，通过调节DARPP32的表达影响蛋白磷酸化，通过调节细胞周期影响细胞的生长，进而参与对胃癌多药耐药的调控。5）DARPP-32是一个新的胃癌多药耐药相关分子。ZNRD1在DARPP-32介导的胃癌多药耐药调控中发挥重要作用，二者具有应用于联合基因治疗的前景。