TBC1D15基因糖代谢调节功能的研究

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目的利用CRISPR/Cas9系统敲除L02和L6细胞的TBC1D15基因,从细胞水平上研究TBC1D15与糖代谢的关系,为新型降糖药物设计提供潜在靶标。方法首先针对大鼠Tbc1d15基因的CDS序列设计并构建5个包含sgRNA序列的pX459重组载体。通过MTT实验确定L02和L6细胞的最佳嘌呤霉素筛选浓度,随后用已有的pX462重组质粒转染L02细胞,用pX459重组质粒转染L6细胞,利用T7E1核酸内切酶检测敲除效率,用有限稀释法筛选出单克隆细胞株,然后利用Western Blotting和基因组PCR分别验证TBC1D15在蛋白水平和基因组水平的变化。在功能研究方面,通过2-NBDG葡萄糖荧光类似物培养,经流式细胞仪检测糖吸收情况。利用Western Blotting技术检测了胰岛素刺激下野生型和TBC1D15-/-细胞的GLUT4、Rab7和LC3B的表达变化。筛选能在1014 d杀死全部L02和L6细胞的最低G-418浓度,构建HA-GLUT4-EGFP表达载体,转染野生型和TBC1D15-/-L02细胞,筛选稳转细胞株。利用免疫荧光技术在激光共聚焦显微镜下观察野生型和TBC1D15-/-L02细胞的Rab7的分布以及分别和GLUT4及Lamp1的共定位情况。结果MTT实验获得L02和L6细胞的最佳嘌呤霉素筛选浓度分别为1.5μg/mL和5.0μg/m L。T7E1核酸内切酶检测敲除效率的结果显示,pX459-1、pX459-2、pX459-3和pX459-4的敲除效率依次为56%、28%、45%和28%。Western Blotting未检测到L02和L6单克隆细胞株表达TBC1D15蛋白,且基因测序结果进一步证明细胞株已成功敲除TBC1D15基因。经流式细胞仪检测,TBC1D15-/-L02和L6细胞的荧光信号强度明显降低,证明其糖吸收能力减弱。Western Blotting结果显示TBC1D15-/-L02和L6细胞的GLUT4和LC3 II水平下调,Rab7表达没有变化。细胞免疫荧光结果表明TBC1D15-/-L02细胞内Rab7发生聚集,且与GLUT4及Lamp1的共定位增加。结论与He La细胞的结果相同,未癌变的细胞中敲除TBC1D15基因也会导致细胞摄取葡萄糖能力下降。TBC1D15通过调节Rab7活性介导GLUT4囊泡从核内体运输到溶酶体。敲除TBC1D15基因后更多GLUT4被分拣至溶酶体降解,从而使细胞糖摄取能力降低。另外,TBC1D15-/-细胞LC3 II水平下降,意味着TBC1D15基因可能与细胞自噬有关。
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