前言　　随着围产医学技术的发展，早产儿及低出生体重儿抢救存活率日益提高，但继之而来的问题是由于高浓度吸氧所导致的慢性肺疾病(Chroniclungdisease，CLD)有逐年上升趋势。CLD成为早产儿最严重的合并症之一，也是婴儿期慢性呼吸系统疾病的主要病因，严重影响了患儿的存活率和生存质量。CLD的发病机制虽尚不完全清楚，但它的病理过程已无可置疑，即是一个组织弥散性肺泡炎和损伤后修复重建的过程，其肺损伤的早期特征是肺水肿，晚期则出现肺间质增生和纤维化。　　以往研究的焦点多集中于CLD晚期的肺纤维化及其可能机制，对早期肺水肿的发生机制研究较少，目前多认为因肺泡-毛细血管壁损伤而介导的渗透性水肿是急性期肺水肿的主要原因。那么肺水肿的形成是否还与肺内液体的清除机制有关，尚不清楚。本研究尝试以研究高氧肺损伤急性期-肺内液体清除机制为切入点，来试图阐明CLD急性期的发病机制，从而为CLD的早期防治奠定实验基础和提供理论依据。　　大量研究表明水通道蛋白1（aquaporin1，AQP1）在肺水的转运肺内液体清除中起着重要的作用。我们既往的研究已经从细胞结构和功能的角度阐明了肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolarepithelialcellⅡ，AECⅡ）是高氧肺损伤的主要靶细胞而且近年来AECⅡ细胞膜上AQP1的发现和证实，进一步奠定了AECⅡ在肺水转运中的地位，揭示了AECⅡ在肺内液体平衡调节中的重要作用。　　基于以上结果本研究拟从组织、细胞和分子水平利用实时荧光定量PCR(polymerasechainreaction)、WesternBlot及RNA干扰(RNAinterference，RNAi)等分子生物学技术来探讨AQP1在CLD急性期肺水肿中的作用及其机制。试图阐明高氧影响肺组织及AECⅡ的AQP1基因及蛋白表达，导致水转运障碍从而导致肺内液体清除障碍可能是高氧肺损伤肺水肿的发病机制之一。从而为CLD的预防和治疗提供一个新思路。　　材料与方法　　一、材料　　Wistar大鼠　　原代培养的AECⅡ　　A549细胞（人肺腺癌细胞系）　　二、方法　　（一）原代细胞培养及鉴定:　　生后24h内Wistar大鼠，无菌取肺，采用胰酶和胶原酶联合消化分离细胞，应用免疫粘附法提纯后原代培养。采用免疫荧光技术及透射电镜对细胞进行鉴定。　　（二）CLD模型鼠肺组织AQP1表达检测　　1、CLD动物模型制备:新生Wistar大鼠生后12h之内随机分为实验组和对照组。实验组置于氧箱中，FiO2=0.90，CO2＜0.5％，湿度60～70％。对照组置于空气中FiO2=0.21，余控制因素同实验组。分别于实验后1、3、7d随机选8只鼠取肺，留待检测。　　2、实时荧光定量PCR法:检测肺组织AQP1mRNA表达。　　3、免疫组化法:检测肺组织AQP1蛋白表达。　　4、Westernblot法:检测肺组织AQP1蛋白表达。　　（三）高氧暴露下原代细胞AQP1表达及其水转运功能检测　　1、收集细胞样本:进行原代细胞培养，细胞贴壁后随机分为实验组和对照组，实验组置于高氧细胞培养箱中(FiO2--0.90)，对照组置于普通细胞培养箱中(FiO2=0.21)，于实验后24、48、72h收集标本冻存待检测。　　2、实时荧光定量PCR法:检测原代细胞AQP1mRNA表达。　　3、Westernblot法:检测原代细胞AQP1蛋白表达。　　4、流式细胞仪:检测原代细胞体积。　　（四）RNAi对A549细胞株AQP1表达及其水转运功能的影响　　1、RNAi:抑制A549细胞AQP1表达　　2、实时荧光定量PCR法:检测RNAi后AQP1mRNA的抑制情况　　3、Westernblot法:检测RNAi后AQP1蛋白抑制情况　　4、流式细胞仪:检测A549细胞体积　　5、渗透性水通透率计算:水转运功能　　三、统计学分析　　应用SPSS13.0软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差((x)±s)表示。采用两因素方差分析方法，应用Lmatrix子句（对矩阵进行编程分析）设定进行指定两组之间的比较。P＜0.05有统计学差异。　　结果　　一、原代细胞培养鉴定结果　　1、形态学结果　　原代培养的AECⅡ在18-24小时后贴壁，细胞为立方形或多角形聚集在一起，形成小岛样结构，胞浆内有大量反差明显的小颗粒，培养72小时后颗粒减少，6-7天后细胞失去特征。　　2、免疫荧光鉴定结果　　表面活性蛋白C(SP-C)在AECⅡ特异性表达，胞浆内绿色荧光为阳性染色。　　3、透射电镜鉴定结果　　电镜下可见AECⅡ内的特征性结构板层小体，其呈同心圆状或平行排列的板层结构，还可见到线粒体、内质网、高尔基体等细胞器，细胞游离面可以见到微绒毛。　　二、CLD模型鼠肺组织AQP1的动态表达　　（一）肺组织AQP1mRNA的动态表达　　实验组AQP1mRNA表达在3d、7d时明显低于对照组，随高氧暴露时间延长持续下降(P＜0.01)。　　（二）肺组织AQP1蛋白的动态表达　　1、免疫组化:3d、7d实验组较对照组AQP1蛋白表达降低，随高氧暴露时间延长持续下降(P＜0.01)。　　2、Westernblot:与免疫组化结果基本一致，3d、7d实验组AQP1蛋白表达较对照组降低，随高氧暴露时间延长持续下降(P＜0.01)。　　三、高氧暴露下AQP1在原代培养AECⅡ的动态表达　　1、AQP1mRNA在AECⅡ的动态表达　　实时荧光定量PCR分析实验组与对照组比较AQP1mRNA的表达48h增加，P＜0.01差异显著。24h、72h表达P＞0.05无明显差异。实验组AQP1mRNA的表达呈现先增高后下降趋势，P＜0.01差异显著。　　2、AQP1蛋白在AECⅡ的动态表达　　Wsternblot方法分析显示48h、72h实验组与对照组比较AQP1蛋白表达增加，P＜0.01差异显著，24h表达P＞0.05无明显差异。实验组AQP1蛋白表达呈先上升后下降趋势，P＜0.01差异显著。　　3、高氧暴露下原代培养的AECⅡ体积情况　　实验组与对照组比较24h、48h、72h细胞体积均增加，P＜0.01差异显著。实验组随着高氧暴露时间的延长，体积逐渐增加，P＜0.01差异显著。　　四、RNAi对A549细胞株AQP1表达及其功能的影响　　（一）RNAi抑制A549细胞表达AQP1基因沉默效果检测　　1、AQP1mRNA在A549细胞的表达　　48h基因沉默组与阴性对照组比较AQP1mRNA表达明显下调(P＜0.01)　　2、AQP1蛋白在A549细胞的表达　　72h基因沉默组与阴性对照组比较AQP1蛋白表达明显下调(P＜0.01)。AQP1蛋白抑制率81.5％。　　（二）RNAi后A549细胞体积情况　　空气中72h基因沉默组体积小于阴性对照组(P＜0.01)。高氧暴露下48h、72h基因沉默组体积小于阴性对照组(P＜0.01)。　　（三）RNAi后渗透性水通透率计算　　空气中48h、72h基因沉默组渗透性水通透率小于阴性对照组(P＜0.01)。高氧暴露下48h、72h基因沉默组渗透性水通透率小于阴性对照组(P＜0.01)。　　结论　　1.采用胰酶和胶原酶联合消化分离细胞，免疫粘附法提纯后培养。经免疫荧光及透射电镜鉴定证实成功培养出新生鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞。该方法是一种有效分离纯化培养新生鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的方法，可用于肺泡Ⅱ型上皮细胞功能及肺损伤疾病的体外研究。　　2.高氧诱导下鼠肺组织AQP1表达随高氧暴露时间延长持续降低，原代培养AECⅡ较对照组比较AQP1表达增加，组内呈先增加后下降趋势，细胞体积随高氧暴露时间延长持续增加。揭示了高氧肺损伤时存在组织及细胞AQP1表达异常，这可能是高氧肺损伤肺水肿的原因之一。　　3.应用RNA干扰技术，对A549细胞AQP1基因沉默，沉默组细胞体积及渗透性水通透率小于对照组。揭示了AQP1在细胞的液体转运功能中起重要作用。进一步阐明了AQP1表达异常导致水转运障碍，使肺泡内液体清除减少可能是高氧肺损伤急性期肺水肿的主要原因之一。