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普洱茶(熟茶)是以云南大叶种晒青毛茶为原料,经渥堆发酵等工序加工而成的特色茶叶。渥堆发酵是普洱茶(熟茶)品质形成的关键工序。在渥堆发酵过程中存在多种微生物,特别是真菌菌落,对茶叶内含成分和品质产生深刻影响。多年来,在普洱茶大规模渥堆发酵样中发现,原本性质稳定的咖啡碱含量会发生显著的下降,因而推测在普洱茶渥堆发酵中存在一种或多种微生物具有降解咖啡碱的能力。前人虽然在茶园和咖啡园的土壤中筛选出几株可降解咖啡碱的细菌或真菌菌株,但在发酵茶叶中定向筛选降解咖啡碱的菌株尚属首次。因此,本研究采用液态和固态筛选培养基,对渥堆发酵中降解咖啡碱的菌株进行了筛选;采用分子生物学方法,对可降解咖啡碱的有效菌株和普洱茶渥堆发酵的优势菌株进行了鉴定;并基于UPLC-QTOF-MS代谢组学及Label-free蛋白质组学等方法,对可降解咖啡碱菌株作用下的咖啡碱降解途径,以及与咖啡碱降解代谢相关的蛋白进行检测分析。主要研究结果如下:1)普洱茶渥堆发酵中嘌呤碱和真菌数量变化本研究在普洱茶大生产过程中和实验室条件下模拟普洱茶大生产自然渥堆发酵,采用HPLC法对咖啡碱、可可碱和茶叶碱等嘌呤碱含量进行测定,参照《霉菌和酵母计数》方法对渥堆发酵中真菌数量进行测定。结果表明:普洱茶自然渥堆发酵中咖啡碱含量显著下降(p<0.05),降幅达29.12%;茶叶碱含量大幅度增加(p<0.05),从最初的0.43±0.052mg/g增加至9.18±0.755mg/g;真菌数量也存在显著变化(p<0.05),维持在5×104 CFU/g～1.2×106 CFU/g水平。在普洱茶渥堆发酵中真菌种类与数量对咖啡碱和茶叶碱含量有深刻影响。2)普洱茶渥堆发酵中可降解咖啡碱菌株的筛选与鉴定本研究采用咖啡碱液态筛选培养基和固态筛选培养基,对普洱茶渥堆发酵中分离纯化出的菌株进行了初筛、复筛,确定菌株PE-5具有潜在的咖啡碱降解能力,该菌株在48h内能对咖啡碱的降解率达87.7%。经分子生物学鉴定为聚多曲霉(Aspergillus sydowii NRRL250)。采用分子生物学方法对渥堆发酵中的5株优势菌株进行鉴定,分别鉴定为Aspergillus niger NCBT110A(黑曲霉)、Aspergillus pallidofulvus NRRL4789、Aspergillus sesamicola CBS137324、Aspergillus sydowii NRRL250(聚多曲霉)和Penicillium mangini CBS253.31。优势菌株占总菌落数量的86.67-97.14%。其中A.pallidofulvus NRRL4789、Aspergillus sesamicola CBS137324 和 Penicillium mangini CBS253.31首次在普洱茶渥堆发酵中被检出。在接种发酵中,Aspergillus niger NCBT110A(黑曲霉)、Aspergillus pallidofulvus NRRL4789、Aspergillus sesamicola CBS137324和Penicillium mangini CBS253.31对咖啡碱、可可碱、茶叶碱等嘌呤碱代谢无深刻影响。仅在聚多曲霉(Aspergillus sydowii NRRL250)接种发酵中存在咖啡碱显著性降低(p<0.05),降幅高达83.89%;茶叶碱大幅度增加(p<0.05),发酵末期茶叶碱含量达25.03±1.172mg/g。因而,本研究确定聚多曲霉(Aspergillus sydowii NRRL250)为普洱茶渥堆发酵中可降解咖啡碱的优势菌株,并具有将咖啡碱转化为茶叶碱的潜在能力。3)聚多曲霉(Aspergillus sydowii NRRL250)作用下咖啡碱降解代谢途径研究为了探究微生物作用下的咖啡碱降解产物,将聚多曲霉和黑曲霉分别接种到含有600mg/L、1200mg/L、1800 mg/L咖啡碱的液态营养培养基内,采用HPLC对咖啡碱的降解产物进行检测。结果表明,黑曲霉对咖啡碱的降解能力有限,咖啡碱几乎不发生降解。在不同咖啡碱浓度下,聚多曲霉对咖啡碱的降解率分别为99.3%,91.3%和62.9%,茶叶碱和3-甲基黄嘌呤为咖啡碱的主要降解产物。在1200mg/L咖啡碱下,聚多曲霉液态培养结束时,茶叶碱和3-甲基黄嘌呤含量分别为549.4±29.3 mg/L和178.7±10.8 mg/L。同时,本研究探究了底物浓度、反应温度、pH值等因素对咖啡碱降解能力的影响,确定聚多曲霉作用下咖啡碱降解的最佳底物浓度为1200mg/L咖啡碱、反应温度为30℃、pH值为6。以原料组和灭菌处理组为对照,采用UPLC-QTOF-MS代谢组学方法,对聚多曲霉接种发酵组中的代谢成分进行检测与分析,共检出9种与咖啡碱降解代谢相关的物质,其中茶叶碱、3-甲基黄嘌呤、拟黄嘌呤、7-甲基黄嘌呤、1-甲基黄嘌呤、1-甲基尿酸、次黄嘌呤有显著性增加(p<0.05)。在聚多曲霉作用下,通过N-脱甲基作用,咖啡碱存在两种降解途径,即以咖啡碱→茶叶碱→3-甲基黄嘌呤降解途径为主,以咖啡碱→拟黄嘌呤→7-甲基黄嘌呤降解途径为辅。通过氧化作用,部分降解产物发生氧化,分别形成1-甲基尿酸和1,7-二甲基尿酸。4)基于蛋白质组学的咖啡碱降解代谢相关酶分析将聚多曲霉接种至无菌的茶汤中进行液态发酵,采用HPLC法对咖啡碱、可可碱和茶叶碱进行测定。结果表明在聚多曲霉液态发酵中咖啡碱显著降低(p<0.05),茶叶碱急剧增加(p<0.05),可可碱保持基本稳定。在聚多曲霉作用下,咖啡碱大量转化为茶叶碱。采用Label-free蛋白质组学,对聚多曲霉茶汤液态发酵中蛋白质进行分析,与基本营养基液态培养对比,在聚多曲霉液态发酵中存在149个差异蛋白;液态发酵中不同阶段样CT4d:CT7d(发酵4天对比发酵7天)中共检出140个相同蛋白和232个差异蛋白。在140个相同蛋白中有94个蛋白在表达上存在显著差异,只有46个蛋白在表达上无显著变化。根据Gene ontology(GO)注释结果,在茶汤液态发酵中发现多种与茶多酚、糖、氨基酸、咖啡碱代谢相关的蛋白(酶),为聚多曲霉的进一步研究和应用提供了一定参照。