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背景:基于表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变的靶向治疗已经逐渐成为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)综合治疗的一部分,临床迫切需要EGFR基因突变检测技术以确定靶向治疗敏感患者,并监测其耐药后新出现的基因突变,以提供个体化诊疗及临床决策指导。与组织活检相比,循环中游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)与肿瘤所包含基因突变信息具有高度一致性,能实时、全面地反映肿瘤全部的遗传学信息,因此目前血液已成为EGFR突变检测常规检材。唾液同样提供了高质量的基因组DNA,作为cfDNA来源与血液相媲美,由于取材方便、无创且避免血源性感染等独特优势有望成为EGFR突变检测理想的补充检材。但体液中cfDNA含量少且肿瘤突变频率低,EGFR突变的检测需要更加敏感的方法。绝对定量的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddRCR)技术具有更高的准确性,更高的分辨率和更高的灵敏度,可实现对cfDNA低频率突变的检测,满足目前临床上对于靶向治疗EGFR基因突变的检测需求。方法:以ddPCR技术为基础,针对EGFR基因突变(Exonl9Dels、T790M和L858R)设计相关的探针引物,建立并优化ddPCR反应体系,确立最佳退火温度并分析该技术的灵敏度。在此基础上,对EGFR-T790M突变检测进行初步的性能验证并证实其临床实用性。主要包括线性范围、空白检测限、分析特异度、分析灵敏度、重复性、批间精密度和准确度。采用荧光定量PCR技术检测NSCLC患者唾液中cfDNA含量,应用上述建立的ddPCR技术检测配对的血浆和唾液样本中EGFR突变,分析两者一致性。结果:建立并优化EGFR基因突变(Exonl9Dels、T790M和L858R)的ddPCR反应体系,确立最佳退火温度分别为60.1℃、58.2℃和58.2℃。对于灵敏度的分析,其突变检测限可达到0.5%,0.05%和0.1%。在此基础上,应用ddPCR检测EGFR-T790M,对该技术的实际检测结果与预期突变比率进行线性评估示R2>0.99,空白检测限为突变微滴数目≥2,特异性为100%,重复性检测结果为CV<20%,批间精密度的检测结果为CV<20%。准确度的相对偏差在±10%范围内。应用建立的T790M突变检测技术,对72例NSCLC患者cfDNA样本进行基因突变检测,与伯乐ddPCR突变检测的一致性为91.67%(k=0.749;P<0.001)。NSCLC患者的唾液cfDNA含量与健康志愿者或良性疾病患者的cfDNA含量没有统计学差异,唾液cfDNA浓度显着低于血浆cfDNA浓度,而且两者间相关无显著性(Spearman等级相关性r=-0.123,P=0.269)。37例血浆和唾液配对标本中,EGFR3种突变的总体一致性为 83.78%(31/37;k=0.602;P<0.001)。结论:成功建立EGFR基因突变(Exon19Dels、T790M和L858R)ddPCR检测技术,并证实具有良好的灵敏度,满足临床样本的检测需求。在此基础上,应用建立的T790M突变检测技术,进行一系列性能验证。表明该技术具有良好的特异性、灵敏度、重复性、批间精密度和准确度,并证实该技术的临床实用性,预示具有广阔的临床应用和市场开发前景。此外,尽管唾液cfDNA水平不适用于NSCLC的诊断,但上述ddPCR技术可用于唾液cfDNA-EGFR突变检测,唾液和血浆cfDNA之间EGFR突变检测具有较好一致性。