稳定表达EGFP人食管癌细胞系及其可视化动物模型的建立

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目的:  利用EGFP表达质粒转染食管癌EC9706细胞系,建立稳定表达EGFP的细胞系EC9706-EGFP;对比EGFP转染对EC9706细胞系细胞生物学特性的影响;进而建立SCID小鼠皮下移植模型,并通过活体荧光成像系统进行分子成像观察。  方法:  将pEGFP-C1、pEGFP-C3、pIRES2-EGFP、pIRES-hrEGFP四种质粒扩增后,利用质粒提取试剂盒分别进行提取、纯化及鉴定。分别利用以上四种质粒对EC9706细胞系进行瞬时转染,通过荧光显微镜选择出荧光表达率最高的质粒。利用最佳质粒对EC9706细胞系进行稳定转染,通过G418耐药筛选及有限稀释法,筛选出单细胞生长并表达荧光的克隆进行扩大培养,建立稳定表达EGFP的细胞系EC9706-EGFP。通过细胞生长曲线、细胞侵袭性实验分析转染前后的EC9706细胞特性有无差别。利用EC9706-EGFP对SCID小鼠进行皮下接种,3周后通过活体成像系统观察并解剖小鼠,对皮下肿物进行HE染色,将病理学结果与荧光成像的结果进行对比。  结果:  pEGFP-C1、pEGFP-C3、pIRES2-EGFP、pIRES-hrEGFP四种质粒纯度分别为1.84、1.79、1.81、1.83,且酶切及测序结果与四种质粒的特性完全符合,证明该四种质粒纯度均较高,可用于后续实验。通过瞬时转染显示经pEGFP-C1质粒转染的细胞荧光表达率最高。利用pEGFP-C1质粒对EC9706细胞系进行稳定转染,成功建立了稳定表达EGFP基因的细胞株EC9706-EGFP。细胞生长曲线、细胞侵袭性,实验显示转染前后两组细胞的生长和侵袭性未见明显差异。利用EC9706-EGFP建立SCID小鼠皮下移植模型,3周后行活体成像观察,发现皮下肿物信号能很好地被活体荧光成像系统探测到。处死小鼠收获皮下瘤行病理检查,见皮下肿物符合鳞状细胞癌特征,证实了活体成像的结果。  结论:  利用pEGFP-C1质粒转染食管癌EC9706细胞可以获得稳定表达EGFP的细胞株。外源基因EGFP的转染并未对食管癌EC9706细胞的生长和侵袭性产生影响。利用EC9706-EGFP细胞系对SCID小鼠进行皮下接种,可以成功建立可视化的SCID小鼠皮下移植模型。
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