激光光镊子拉曼光谱技术(Laser Tweezer Raman spectroscopy,LTRS)能够对溶液中的单个活细胞或细胞器形成三维囚禁,对囚禁物中的分子结构信息以光谱的形式输出,具有高灵敏性、高特异性、快速检测等优势,能够对单个活体细胞进行实时监测。本研究应用LTRS技术对单个活体酵母细胞在高浓度乙醇诱导凋亡的过程进行实时监测,并结合分光光度计法、氧电极法研究凋亡过程中线粒体的生理生化变化;同时还利用了该技术研究铝胁迫蚕豆根尖原生质体细胞凋亡过程的生理生化变化过程。主要研究结果如下:(1)本研究应用光镊拉曼光谱技术,目的在于分别于群体细胞水平和单个酵母细胞水平上,对高浓度乙醇胁迫过程中细胞内生物大分子物质的动态变化进行实时监测。基于两种水平上的研究结果显示:在高浓度乙醇胁迫下,归属于核酸的拉曼峰(721,1083,1301 cm-1)、归属于蛋白质的拉曼峰(721,858,1001,1301,1445,1608,1657 cm-1)和归属于脂类(1083,1301,1445 cm-1拉曼峰的峰强度都随处理时间的延长而显著降低,说明了高浓度乙醇诱导酵母凋亡过程中核酸、蛋白质、脂类等物质的含量是逐渐降低的。结合单因素分析法与重复测量分析法发现,群体细胞与单个细胞的光谱的变化有明显差异性,反映基于群体细胞的研究,个体细胞的信息被平均光谱信息所掩盖,无法体现个体间所存在的差异。应用激光镊子拉曼光谱技术(LTRS)基于单个细胞水平上的研究能更直接、更真实地反映高浓度乙醇胁迫下细胞内生物大分子变化的动态信息。高浓度乙醇胁迫酵母细胞能诱导其发生凋亡,应用光镊拉曼光谱技术结合氧电极测量法对酵母细胞发生凋亡的过程中线粒体结构和功能的变化进行检测,结果显示:乙醇胁迫酵母后其线粒体的细胞色素C氧化酶、NADH氧化酶、琥珀酸氧化酶活性受到抑制,分别随乙醇浓度的增加和胁迫时间的延长而降低,同时丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量检测发现,膜脂过氧化程度也随着乙醇浓度的增加和胁迫时间的延长而加深,表明高浓度乙醇胁迫酵母其线粒体内重要的氧化酶活性受到抑制,甚至失活,膜脂过氧化程度加深,线粒体膜结构遭到破坏,膜通透性增加;呼吸控制率(Respiratory control ratio,RCR)和磷氧比(P/O)的降低也进一步表明了线粒体结构和功能遭到破坏,氧化磷酸化机能受损;同时在此过程中也伴随有线粒体细胞色素C含量下降,表明高浓度乙醇胁迫酵母细胞凋亡的过程中线粒体外膜通透性增加,细胞色素C释放;在拉曼光谱的检测结果中,与核酸相关的谱峰(1083、1301 cm-1)、与蛋白质相关的谱峰(1001、1448、1603、1663 cm-1)、与脂类相关的谱峰(1083、1301、1448 cm-1)以及表征细胞色素C的特征峰(750、1125 cm-1)强度都随乙醇浓度的增加和胁迫时间的延长而呈规律性降低,表明高浓度乙醇胁迫的条件下线粒体的这些结构物质流失;另外细胞色素C的特征峰(750、1125 cm-1)强度的下降表明线粒体内细胞色素C含量的下降,与常规细胞色素C含量检测结果一致,谱峰1603 cm-1强度的降低也进一步表明了高浓度乙醇胁迫酵母,其线粒体的能量代谢受阻。(2)在本研究中以蚕豆为材料,分别用不同浓度的AlC13处理4 d和一定浓度的AlC13(200 μM)处理不同时间诱导蚕豆根尖细胞发生凋亡,采用DAPI染色法检测蚕豆根尖细胞的凋亡情况,并将酶解法获得的根尖原生质体细胞应用蔗糖梯度法分离得到成熟的大小基本一致的原生质体细胞,应用激光光镊拉曼技术分别对这些细胞进行了拉曼光谱研究。结果显示,铝能够诱导蚕豆根尖细胞发生凋亡,经50 μMAlC13胁迫4d后,根尖细胞核的DAPI着色加重,经300μM AlC13胁迫4d后,根尖细胞核变形,核形状不规则化加重,DAPI染色不均一,发出亮蓝色荧光,表明细胞发生了凋亡;而200 μMAlC13胁迫蚕豆根尖不同时间的研究结果也显示,根尖细胞的DAPI染色也随着200 AlC13胁迫时间的延长而逐渐加重,当胁迫时间为4 d时,经染色的细胞发出亮蓝色荧光,表明细胞发生凋亡。此外,拉曼光谱的研究结果还发现,在铝诱导蚕豆根尖细胞发生凋亡的过程中,与核酸(716、1050、1083、1379 cm-1)、蛋白质(863、941、1211、1340、1460cm-1)、碳水化合物(766、1050、1460 cm-1)及脂质(612、716、1127、1266 cm-1)等大分子物质相关的细胞拉曼特征峰强度发生规律性变化,即随着胁迫的铝离子浓度的升高和铝胁迫时间的延长,这些拉曼谱峰的强度逐渐下降,表明在铝诱导蚕豆根尖细胞发生凋亡的过程中,细胞内核酸、蛋白质、碳水化合物及脂质等大分子物质含量下降。