【摘 要】
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目的从表观遗传学角度出发,探究神经母细胞瘤（Neuroblastoma,NB）中MYCN异常高表达的表观遗传学调控机制,筛选出与MYCN表达密切相关的长链非编码RNA（Long non-coding RNA,LncRNA）,体内外实验验证LncRNA-AC142119.1的生物学功能,并阐明LncRNA-AC142119.1调控MYCN表达的具体分子机制。方法利用LncRNA表达谱芯片技术筛选出M
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目的从表观遗传学角度出发,探究神经母细胞瘤（Neuroblastoma,NB）中MYCN异常高表达的表观遗传学调控机制,筛选出与MYCN表达密切相关的长链非编码RNA（Long non-coding RNA,LncRNA）,体内外实验验证LncRNA-AC142119.1的生物学功能,并阐明LncRNA-AC142119.1调控MYCN表达的具体分子机制。方法利用LncRNA表达谱芯片技术筛选出MYCN扩增与非扩增的NB细胞系中差异表达的LncRNAs;生物信息学分析与MYCN基因位置最邻近且差异倍数最大的LncRNAs;c DNA末端快速扩增技术（rapid amplification of c DNA ends,RACE）检测LncRNA-AC142119.1在NB细胞中的序列,并根据序列预测其编码能力;核质分离q RT-PCR和荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）分析LncRNA-AC142119.1在细胞中的定位。收集重庆医科大学附属儿童医院确诊的56例NB肿瘤组织,利用q RT-PCR技术检测NB肿瘤组织中LncRNA-AC142119.1和MYCN的表达水平,并分析其相关性。构建LncRNA-AC142119.1过表达慢病毒,同时设计并合成针对LncRNA-AC142119.1的Locked Nucleic Acid（LNA）Gapme Rs。在NB细胞株中分别过表达和敲低LncRNA-AC142119.1后,q RT-PCR技术检测LncRNA-AC142119.1和MYCN的表达变化;蛋白质免疫印迹（Western blot,WB）检测其对MYCN蛋白表达的影响;CCK-8检测LncRNA-AC142119.1对细胞增殖活性的影响;流式细胞术检测LncRNA-AC142119.1对细胞周期的影响;动物实验检测LncRNA-AC142119.1对裸鼠移植瘤生长的影响。RNA pull-down结合质谱技术检测与LncRNA-AC142119.1结合的组蛋白甲基转移酶;利用RNA pull-down结合WB技术验证LncRNA-AC142119.1与WDR5结合的具体碱基序列;RIP实验验证WDR5与LncRNA-AC142119.1的结合;Ch IP-PCR检测LncRNA-AC142119.1对MYCN启动子区域组蛋白3第4位赖氨酸的三甲基化（H3K4me3）水平的影响。。结果LncRNA表达谱芯片筛选出MYCN扩增与非扩增的NB细胞系中差异表达的LncRNAs,找到与MYCN位置邻近且差异倍数最大的LncRNA-AC142119.1。RACE实验证实LncRNA-AC142119.1为924bp的核酸序列,生物信息学预测LncRNA-AC142119.1为非编码RNA。核质分离q RT-PCR和FISH实验显示LncRNA-AC142119.1定位于细胞核。q RT-PCR结果表明,在NB肿瘤组织中LncRNA-AC142119.1与MYCN表达呈正相关。在NB细胞系中过表达LncRNA-AC142119.1后MYCN表达亦增高,反之亦然。CCK-8和细胞周期分析发现LncRNA-AC142119.1能够显著增强NB细胞增殖能力,并促进NB细胞通过G1/S细胞周期关卡。体内实验表明LncRNA-AC142119.1可显著促进NB细胞在裸鼠体内的生长能力。RNA pull-down结合质谱检测筛选出与LncRNA-AC142119.1相互作用的蛋白WDR5,RNA pull-down结合WB结果显示LncRNA-AC142119.1与WDR5结合的位点位于其1-400bp区域。RIP实验进一步验证WDR5可与LncRNA-AC142119.1结合。Ch IP-PCR结果显示LncRNA-AC142119.1可增强MYCN启动子区域H3K4me3水平。结论LncRNA-AC142119.1可能通过与WDR5结合,导致MYCN启动子区H3K4me3水平增加,进而促发MYCN转录激活与表达,促进NB细胞通过G1/S细胞周期关卡,最终致使NB恶性增殖和进展。
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