目的:冠心病是一种严重威胁人类身体健康的疾病,近年我国冠心病的发病率及死亡率呈现逐渐升高的趋势。本病由于冠状动脉狭窄或闭塞导致心肌缺血、坏死,进而影响心脏功能,冠脉侧枝循环的建立则具有保护作用。治疗性血管新生通过促进缺血局部新生血管的生成,为不适于手术的严重冠心病患者提供了一个充满希望的、崭新的治疗方法。中医药治疗冠心病有着悠久的历史,我们根据传统中医理论,结合文献及临床研究,认为血脉不和是冠心病的重要病机,因此提出以调和血脉为内涵的和血生络治法。本课题通过建立实验性心肌梗死模型,观察和血生络法对心梗模型心功能、血管新生及血管内皮舒张功能的影响,明确和血生络法对冠心病心肌缺血的促血管新生治疗作用,并利用细胞培养及离体主动脉环方法探讨了和血生络法促血管新生的作用基础及血管内皮保护的作用机制。第一部分心肌梗死大鼠血管新生及血管舒张功能的变化及和血生络法的干预作用方法:健康雄性Wistar大鼠96只,通过结扎冠状动脉左前降支建立实验性心肌梗死动物模型。选取造模成功大鼠48只,按照随机数字表法随机分为模型组(AMI)、消心痛组(ID)、和血生络低剂量组(HXSL-L)、和血生络高剂量组(HXSL-H),每组12只;另设假手术组(SHAM)大鼠12只。术后24h灌胃给药,药物干预4周后,利用彩色多普勒超声仪检测左心室收缩功能;采用TTC染色法测定大鼠左室心肌梗死范围;采用免疫组化方法,通过检测心肌梗死边缘区第八因子(VIII)表达,测定缺血局部微血管密度;采用免疫组化方法检测心肌梗死边缘区VEGF蛋白表达;采用酶联免疫吸附法、分光比色法检测血清VEGF、NO、NOS含量;利用离体主动脉环灌流方法检测大鼠血管舒张功能。结果:1大鼠一般状况的比较:造模后前3天,大鼠饮食、活动均减少。实验过程中,模型组大鼠饮食、活动较少,皮毛欠光泽,增重较缓慢,甚至无增重;其余各药物干预组,大鼠精神状态渐好转,不同程度增重,以和血生络大剂量组最明显。2左心室收缩功能:假手术组大鼠LVIDd、LVIDs、LVFS和LVEF分别为5.52±0.71、3.08±0.71、44.12±3.80、80.47±3.46,模型组大鼠分别为8.03±1.10、6.30±1.14、21.97±3.98、47.50±7.20,与假手术组大鼠比较,模型组大鼠LVIDd、LVIDs显著升高( P<0.01),LVEF和LVFS显著降低(P<0.01),提示模型大鼠左心室收缩功能受损。和血生络高剂量组LVFS和LVEF分别为42.93±2.80、78.75±3.12,低剂量组分别为37.45±3.81、72.25±4.43,消心痛组分别为35.20±4.88、68.92±6.63,和血生络高剂量组、低剂量组及消心痛组大鼠左心室收缩功能较模型组大鼠均明显提高( P<0.01),中药高剂量组明显优于低剂量组及消心痛组( P<0.01),其左室射血分数几乎接近正常水平。3心肌梗死范围:假手术组大鼠无心肌梗死。模型组大鼠心肌梗死范围为(31.50±5.59)%,和血生络高剂量组、低剂量组及消心痛组大鼠心肌梗死范围分别为(18.69±3.50)%、(25.08±4.12)%、(25.05±5.81)%,各治疗组梗死范围均明显小于模型组(P<0.05~0.01),中药高剂量组明显优于低剂量组及消心痛组(P<0.05),差别具有统计学意义。4心肌梗死边缘区微血管数量和微血管密度(MVD):假手术组大鼠MVD为85.92±8.83,模型组大鼠为105.77±7.63,与假手术组大鼠比较,模型组大鼠MVD显著增高(P<0.05);和血生络高剂量组、低剂量组及消心痛组大鼠MVD分别为135.65±9.65、124.92±7.04、116.69±5.31,各治疗组(HXSL-L组、HXSL-H组、ID组)微血管密度(MVD)明显高于模型组(P<0.05)。5血清VEGF、NO、NOS含量:假手术组大鼠血清VEGF、NO、NOS分别为42.53±4.37、34.07±4.98、18.34±2.71,模型组大鼠血清VEGF、NO、NOS分别为44.93±5.95、19.24±4.42、14.54±2.59,模型组与假手术组大鼠血清VEGF含量无明显差别(P>0.05),模型组血清NO、NOS含量明显低于假手术组(P<0.01);和血生络高剂量组血清VEGF、NO、NOS分别为63.23±8.44、44.77±9.98、23.07±3.33,低剂量组分别为51.65±7.15、31.51±9.37、20.26±3.52,消心痛组分别为51.42±5.86、25.65±6.73、17.70±3.26,和血生络高、低剂量组及消心痛组大鼠血清VEGF、NO、NOS含量明显高于模型组(P<0.05~0.01),和血生络高剂量组优于其它处理组(P<0.05~0.01)。6心肌梗死边缘区VEGF蛋白表达免疫组化检测:假手术组、模型组、和血生络高、低剂量组及消心痛组大鼠VEGF蛋白表达分别为148.95±43.36、244.66±69.91、477.23±124.16、402.49±83.56、351.79±66.08,与假手术组大鼠比较,模型组大鼠心肌梗死边缘区VEGF蛋白表达明显增高(P<0.05) ;各治疗组大鼠VEGF蛋白表达明显高于模型组(P<0.05~0.01),中药高剂量组增高最突出(P<0.05)。7大鼠胸主动脉环舒张功能:模型组大鼠Ach各浓度血管舒张率分别为(8.00±2.49)%、(23.14±5.06)%、(41.37±8.44)%、(63.87±7.72)%,假手术组分别为(18.3±3.62)%、(54.68±5.48)%、(73.58±7.53)%、(85.20±9.51)%,模型组大鼠内皮依赖性血管舒张功能较假手术组明显下降(P<0.05),提示心梗后血管内皮功能受损。和血生络高剂量组Ach各浓度血管舒张率分别为(20.13±3.12 )%、(51.29±5.75)%、(73.57±9.55)%、(86.53±9.72)%,低剂量组分别为(18.63±3.74)%、(50.21±8.34)%、(69.91±6.17)%、(81.74±8.13)%,消心痛组分别为(13.76±3.14)%、(41.08±5.75)%、(63.80±6.93)%、(78.25±7.95)%,和血生络高剂量组、低剂量组及消心痛组内皮依赖性血管舒张功能较模型组明显改善(P<0.05~0.01),和血生络高剂量组优于低剂量组及消心痛组(P<0.05)。各组大鼠非内皮依赖性血管舒张功能无明显区别(P>0.05)。第二部分和血生络法对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移的影响方法:采用人脐静脉内皮细胞系ECV-304为模型。实验分组如下:①正常对照组。②和血生络方处理组(ECV-304细胞贴壁培养24h后,分别换含药物0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL浓度的RPMI-1640培养液培养)。每组实验重复3次。采用MTT法测定人脐静脉内皮细胞增殖,细胞划痕法检测细胞迁移,流式细胞技术分析细胞DNA含量。结果:1和血生络方对ECV-304细胞增殖的影响:正常对照组吸光度值为0.727±0.045,和血生络方各剂量组(0.5mg/mL~4mg/mL)吸光度值分别为0.820±0.020、0.967±0.021、1.027±0.045、1.517±0.035,与正常对照组比较,和血生络方各剂量组均可促进ECV-304细胞增殖(P<0.05或P<0.01),且呈剂量依赖性方式。2和血生络方对ECV-304细胞增殖的时间作用影响:正常对照组ECV-304细胞24h、48h、72h、96h吸光度值分别为0.143±0.006、0.187±0.015、0.310±0.010、0.217±0.021,血生络方固定剂量(2mg/mL)各时段吸光度值分别为0.220±0.010、0.343±0.015、0.427±0.031、0.337±0.015,正常对照组及和血生络方固定剂量组随作用时间的延长,内皮细胞逐渐增殖,72h达到峰值;和血生络24h、48h、72h、96h各组,吸光度值均显著高于同时段正常对照组(P<0.01)。3流式细胞仪检测细胞周期:正常培养的ECV-304细胞周期中G0/G1期、S期及G2/M期细胞百分比分别为(76.73±1.21)%、(10.93±0.68)%、(12.35±0.92)%,分布比例正常;和血生络组(2mg/mL)细胞周期中G0/G1期、S期及G2/M期细胞百分比分别为(69.02±0.95)%、(17.00±0.42)%、(13.98±0.87)%,和血生络组G0/G1期细胞百分率较正常对照组显著下降(P<0.01),S期细胞百分率显著增高(P<0.01),而M期无明显变化(P>0.05)。4和血生络方对ECV-304细胞迁移的影响:正常对照组ECV-304细胞6h迁移率为(17.49±0.45)%,24h迁移率为(41.32±1.90)%,和血生络方各剂量组(0.5mg/mL~4mg/mL)细胞6h迁移率分别为(18.39±0.43)%、(23.22±1.84)%、(31.35±1.56)%、(38.52±2.79)%,24h迁移率分别为(44.79±1.20)%、(52.30±2.84)%、(61.11±2.82)%、(73.98±3.86)%,和血生络方各剂量组细胞迁移率均显著高于同时段正常对照组(P<0.05或P<0.01),且具有剂量依赖性效应。第三部分和血生络法对大鼠离体胸主动脉环的舒张作用及机制探讨方法:采用大鼠离体胸主动脉灌流技术,以累积浓度加药法观察HXSL方药对胸主动脉环基础张力的影响;以去甲肾上腺素(NE)或氯化钾(KCl)预收缩血管环,分别在药物终浓度0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2g/L条件下,观察HXSL方药对内皮完整及去内皮主动脉环张力的影响;分别运用一氧化氮合酶抑制剂左旋硝基精氨酸甲酯(0.1mmol/L)、鸟苷酸环化酶抑制剂亚甲蓝(10μmol/L)、环氧合酶抑制剂吲哚美辛(10μmol/L)及β受体阻制剂普萘洛尔(10-6mol/L)处理血管环,观察HXSL方药对去甲肾上腺素(NE)预收缩内皮完整主动脉环张力的影响。结果:1和血生络方对主动脉环基础张力的影响:基础状态下,各浓度和血生络中药对内皮完整主动脉环及去内皮主动脉环无明显作用(P>0.05)。2和血生络方对NE预收缩主动脉环张力的影响:与对照组比较,和血生络中药各浓度(0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2g/L)对NE预收缩的内皮完整主动脉环均有明显舒张作用(P<0.01),30min血管张力比分别为(78.84±4.30)%、(67.60±4.68)%、(42.15±6.23)%、(19.62±3.31)、(9.36±3.15)%,舒张作用具有浓度依赖性(P<0.01);各浓度和血生络中药对去内皮主动脉环也具有浓度依赖性的舒张作用(P<0.05~0.01),30min血管张力比分别为(91.47±2.05)%、(81.27±3.06)%、(75.17±4.08)%、(60.29±5.23)%、(47.07±5.95)%。同浓度药物对内皮完整主动脉环的舒张作用显著大于对去内皮主动脉环的作用(P<0.01)。3和血生络方对KCl预收缩去内皮主动脉环张力的影响:各浓度和血生络中药对KCl预收缩去内皮主动脉环无明显作用(P>0.05)。4和血生络方对普萘洛尔预处理去内皮主动脉环张力的影响:和血生络中药普萘洛尔预处理去内皮主动脉环无明显作用(P>0.05)。5和血生络方对L-NAME、MB及IM预处理内皮完整主动脉环的影响:和血生络组(0.05g/L)30min血管张力比为(64.29±5.70)%,L-NAME、MB及IM预处理组血管张力比分别为(78.14±4.31)%、(78.09±4.73)%、(62.66±5.41)%;L-NAME、MB预处理后,和血生络中药对内皮完整主动脉环的舒张作用明显减弱(P<0.01);IM预处理后,和血生络中药对内皮完整主动脉环的舒张作用无明显变化(P>0.05)。6和血生络方对NE预收缩主动脉环张力的时间依赖作用:和血生络方药固定浓度(0.05g/L)10min、20min、30min、40min、50min血管张力比分别为(99.5±1.7)%、(88.6±4.5)%、(62.7±9.8)%、(19.5±4.2)%、(4.8±1.1)%,和血生络方药可以时间依赖性的舒张NE预收缩的主动脉环(P<0.05~0.01),药物作用的起始时间为加药后10min左右,血管缓慢舒张至加药后20min左右,然后进入快速舒张阶段,至加药后50min左右达最大舒张。结论:1和血生络法能够改善左心室收缩功能,缩小心肌梗死范围,对大鼠心肌梗死具有治疗作用。2和血生络法能够增加心肌梗死边缘区MVD及心肌VEGF蛋白表达,提高血清VEGF、NO含量,对缺血心肌具有促血管新生作用。3和血生络法能够促进人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移,能够显著降低人脐静脉内皮细胞G0/G1期的细胞百分率,增高S期的细胞百分率,促进了人脐静脉内皮细胞的DNA合成,这些可能为和血生络法促血管新生的作用基础。4和血生络法可以改善心梗大鼠内皮依赖性血管舒张功能,提高血清NO、NOS含量,对心肌梗死大鼠内皮功能障碍具有防治作用。5和血生络法对大鼠胸主动脉环具有内皮依赖性血管舒张、非内皮依赖性血管舒张双重作用。其内皮依赖性血管舒张作用与影响内皮NOS有关,可能通过NO-可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)-环鸟苷酸(cGMP)途径介导了和血生络方的内皮依赖性舒张血管作用。