糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是多病因引起的慢性代谢性疾病,其主要特征是慢性高血糖,并伴随因胰岛素分泌及/或功能缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。糖尿病诱发的多种并发症是造成糖尿病患者高致残率和高死亡率的主要原因。其中,糖尿病性溃疡、坏疽、局部感染等创伤难愈症状的出现与糖尿病患者皮肤组织的创伤愈合能力低下有直接关系,其病理学机制主要是由于严重的神经病变和血管病变所导致的大、中血管和微血管结构及功能异常,而其分子水平机制中,一氧化氮(Nitric Oxide,NO)、NO生成催化剂一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)和超氧阴离子(Supreoxide,O2-)占了很重要的地位。1. NO在创面愈合中的作用和实验目的研究表明NO可参与并促进皮肤组织创伤恢复的整个过程,其作用表现在诱导成纤维母细胞、上皮细胞、内皮细胞和角质细胞的增殖与分化、增进血管生成、参与基质的沉积和重塑、调节创伤愈合后期炎症反应中多种细胞因子的活性等。NO是由一氧化氮合酶氧化精氨酸的胍基氮原子而生成的。一氧化氮合酶有三种独立的亚型:神经型(neuronal NOS,nNOS)、内皮型(endothelial NOS,eNOS)和诱导型(inducible NOS,iNOS)。在其三个亚型中,皮肤组织主要表达的是eNOS,并主要由eNOS维持皮肤组织中NO代谢的平衡。研究发现,增加组织或细胞中eNOS的蛋白表达水平或酶活性可提高NO水平,并促进创伤愈合;反之,则将导致创伤愈合延迟。因此,局部应用NO供体或eNOS对糖尿病性创伤难愈进行治疗,将可能通过提高NO的水平而促进创伤的愈合。2. O2-在创面愈合中的作用和实验目的愈来愈多的研究证据表明,糖尿病可导致多个组织或器官处于氧化应激状态(oxidative stress),并通过氧化反应破坏具有重要功能的生物大分子(如DNA、糖、蛋白质、脂类)的结构和功能,导致多种心血管疾病的发生发展。而糖尿病导致氧化应激的主要机制在于,以O2-为主的活性氧类(reactive oxygen species,ROS)大量生成,破坏了机体的氧化/抗氧化体系的平衡,导致氧化性因素增强、还原性因素减弱而出现氧化应激,并导致细胞、组织的功能损伤;另外,O2-还具有和NO迅速发生化学反应的特性,该反应一方面降低了组织中NO的水平,另一方面生成强氧化剂过氧化亚硝酸对组织造成进一步损伤。进一步研究也发现,糖尿病患者体内的高血糖环境明显刺激O2-的生成反应,并因此危及血管及神经的正常功能,导致糖尿病皮肤创伤难愈的发生发展。而研究也证明减少或阻断O2-的产生或消除已生成的O2-可显著减轻高糖血症对血管功能的损伤。机体内催化O2-生成反应的酶很多,其中在血管内皮系统内催化O2-生成反应的主要是还原型辅酶即NAD(P)H氧化酶、黄嘌呤氧化酶和脱耦联eNOS等三种。而在糖尿病患者血管内皮系统或高糖环境下的各种细胞中,催化O2-生成反应的主要是PKC依赖性的NAD(P)H氧化酶。但有关糖尿病或高糖条件下皮肤整体组织内O2-的生成机制尚未见报道。因此,应用O2-生成抑制剂对糖尿病创伤难愈进行局部治疗,将可能通过降低O2-水平而促进创伤的愈合。基于以上研究资料,本研究拟达成四个目标:1)建立链脲霉素(Streptozotocin, STZ)诱导的I型糖尿病小鼠模型及其创伤难愈模型,为局部用药治疗研究奠定基础;2)采用选择性抑制剂,研究NAD(P)H氧化酶、黄嘌呤氧化酶和脱耦联eNOS三者在糖尿病皮肤组织O2-产生机制中的地位;3)检测创伤前后皮肤组织eNOS及NO水平变化,以及采用不同的NO供体观察其对创面肉芽组织中成纤维细胞增殖的影响;4)通过局部应用不同的药物,观察对糖尿病小鼠创伤愈合的治疗作用,为糖尿病创伤难愈的药物治疗提供理论依据。下面是本研究的主要实验方法、结果及结论:1.模型建立1)建立STZ诱导的I型糖尿病小鼠模型以45 mg/kg STZ对昆明种雄性小鼠进行连续5天的腹腔注射,采集血液测量血糖水平,确定其血糖浓度高于11.1 mmol/L后,连续8周跟踪检测小鼠的血糖浓度及体重变化。检测结果表明小鼠血糖浓度显著增高(p<0.05),而体重明显下降(p<0.05),且体征持续8周以上,与文献报道的STZ糖尿病小鼠模型完全一致,表明STZ在小鼠体内成功诱导I型糖尿病的模型成立。2)建立STZ糖尿病小鼠创伤难愈模型建立STZ糖尿病小鼠模型8周后,以打孔器在小鼠背部制造直径为1cm的圆形创面,跟踪检测其创口愈合速度直至完全愈合。检测结果表明,STZ糖尿病小鼠创口的整个愈合过程比对照组明显滞后(p<0.05),说明手术使STZ糖尿病小鼠出现了创伤难愈现象,也说明糖尿病严重损伤了小鼠皮肤组织的创伤愈合能力。2.STZ糖尿病小鼠皮肤组织O2-生成机制的研究共使用了4种酶活性途径的选择性抑制剂。其中,别嘌呤醇(Allopurinol, ALLO)抑制黄嘌呤氧化酶活性,Nw-左旋精氨酸甲基酯(L-NAME)抑制eNOS酶活性。而抑制NAD(P)H氧化酶活性的有两种:1)夹竹桃麻素(Apocynin,APO)直接抑制NAD(P)H氧化酶活性;2)白屈菜赤碱(Chelerythrine, CHE)通过抑制蛋白激酶C活性而抑制NAD(P)H氧化酶活性。实验结果表明,应用两种NAD(P)H氧化酶活性抑制剂都可以明显抑制STZ糖尿病小鼠皮肤中O2-的生成,说明STZ糖尿病小鼠皮肤上升高的O2- ,绝大部分可能是通过NAD(P)H氧化酶途径产生的。而使用L-NAME和ALLO的实验结果表明,两者都没有明显降低STZ糖尿病皮肤组织中O2-的水平,说明黄嘌呤氧化酶途径和脱耦联eNOS途径所产生的O2-在STZ糖尿病小鼠皮肤组织总O2-中没有或只占了很少的比例。3.创伤对皮肤组织eNOS、NO水平的影响及NO供体对人皮肤成纤维细胞的作用的研究1)观察创伤对皮肤组织eNOS及NO水平的影响通过检测创伤前后糖尿病小鼠和正常小鼠创面皮肤eNOS和NO水平发现:手术前实验组之间eNOS蛋白表达水平无显著差异,糖尿病组相对于正常对照组小鼠皮肤组织NO水平显著下降(p<0.05)。创伤手术后第5天,与术前相比,正常对照组eNOS蛋白表达和NO水平显著升高(p<0.05),而糖尿病组eNOS蛋白表达和NO水平则显著下降(p<0.05)。2)人正常皮肤成纤维细胞的培养取临床包皮环切术切下的组织以酶消化法进行皮肤成纤维细胞的培养,同样利用消化加反复贴壁法,可以去除大部分混杂的其他细胞,得到足够量较纯的成纤维细胞。3)观察不同NO供体对成纤维细胞增殖的影响使用三种不同的NO供体,硝普钠(SNP)、S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)及N-羟基苯磺酰胺,通过3H-TdR掺入法及流式细胞仪检测其供体不同浓度对成纤维细胞增殖的影响,结果发现:SNP在0.01、0.1 mmol/L时促使皮肤成纤维细胞增殖显著多于对照组(p<0.05) ,随着SNP浓度增加到1mmol/L时成纤维细胞增殖明显减少(p<0.05)。GSNO在浓度为0.01mmol/L时,可明显促进细胞增殖(p<0.05),在0.1 mmol/L时与对照组相比无显著差异,在浓度为1、10 mmol/L可明显减少细胞的增殖(p<0.05)。N-羟基苯磺酰胺对细胞增殖的影响作用和GSNO类似。1mmol/L的三种不同药物处理后的细胞经Annexin V-FITC/PI双染流式检测发现均可以导致死亡、凋亡细胞百分比明显增多,以死亡细胞为主。4.STZ糖尿病小鼠创伤难愈的局部用药治疗研究在糖尿病小鼠创面局部使用一定浓度的L-精氨酸(L-arg)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、夹竹桃麻素(APO)或硝普钠(SNP),结果发现:SNP治疗组与正常对照组相比无显著差异(p>0.05),eNOS治疗组、L-arg治疗组及APO治疗组三者比糖尿病对照组创面愈合显著加快(p<0.05)。基于以上实验结果,我们得出以下结论:1) STZ糖尿病小鼠皮肤组织中,O2-升高主要来自NAD(P)H氧化酶途径,而非黄嘌呤氧化酶途径和脱偶联eNOS途径;2) STZ糖尿病小鼠皮肤组织创伤愈合能力低下,并出现明显的创伤难愈症状,这一现象与STZ糖尿病小鼠皮肤组织中NO水平显著下降、O2-水平明显上升有直接关系,也与创伤导致STZ糖尿病小鼠皮肤组织中NO水平进一步下降,eNOS蛋白表达明显降低有关;3)低浓度的NO供体可明显促进人正常皮肤成纤维细胞的增殖,而高浓度的供体可导致成纤维细胞的大量死亡,说明NO对创面肉芽主要构成成分成纤维细胞的生长有双向影响;4)局部应用SNP、eNOS、L-arg或APO通过显著提高皮肤组织NO、eNOS水平,或降低O2-水平对糖尿病性创伤难愈产生明显疗效。