乳转铁蛋白(lactotransferrin, LTF)属于转铁蛋白家族,它是一种具有多种重要生物学功能的糖蛋白。LTF具有参与铁代谢、抗菌、抗真菌、抗病毒、免疫调节和抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种生物学功能。近年来大量的体内外研究显示LTF具有明显的抗肿瘤作用。目前关于LTF对肿瘤细胞直接的作用的机制并不清楚。研究发现,LTF能诱导肿瘤细胞G1/S周期阻滞,并且能调控细胞周期相关蛋白如p21、p27、Rb,LTF也能诱导某些肿瘤细胞发生凋亡。我们前期研究利用湖南鼻咽癌高发家系,通过连锁分析及单体型分析,发现染色体3p21为鼻咽癌易感基因区。而LTF基因正好位于此区域。前期研究发现LTF在鼻咽癌中显著下调或缺失,且其表达水平与鼻咽癌的临床分期、转移及患者预后密切相关。初步功能研究发现,LTF明显抑制鼻咽癌细胞增殖,将细胞阻滞于Go/G1期,并且LTF抑制MAPK信号传导通路,下调cyclin D1、pRb、p21、p27等周期相关蛋白。有研究报道,在鼻咽癌组织和细胞系中LTF基因位点存在杂合性丢失和启动子区域的高甲基化。这些证据提示,LTF在鼻咽癌是一个潜在的抑瘤基因,它在鼻咽癌发生发展中可能发挥重要的作用。在本课题中,为了进一步阐述LTF抑制鼻咽癌生长转移的分子机制,以及LTF在鼻咽癌中表达下调机制,我们进行了以下研究,并取得了相应的结果：1.LTF通过抑制MAPK通路下调PDKl表达,导致AKT活性下调首先,我们通过功能获得和缺失方法证实了LTF具有抑制鼻咽癌生长转移作用。为了研究LTF基因的抑瘤分子机制,采用全基因组表达谱芯片分析及qRT-PCR和Western blot等实验发现,LTF能显著下调PDK1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase1,PDPK1or PDK1)的mRNA及蛋白表达水平。接下来,我们确定LTF能否影响PDK1的转录活性。我们将PDK1启动子克隆入荧光素酶报告载体与LTF表达质粒或LTF shRNA共转染细胞,发现LTF能抑制PDK1的转录活性。因为c-Jun能激活PDK1转录,而以往的研究显示LTF能抑制MAPK通路活性和c-Jun的表达。为了确定LTF抑制PDK1表达是否与抑制MAPK信号通路和c-Jun的表达有关,我们分别用P13K抑制剂LY294002、MEK抑制剂PD98059、JNK抑制剂SP600125处理LTF基因封闭的细胞,观察PDK1表达变化情况。我们发现MAPK抑制剂能拮抗LTF基因封闭细胞的c-Jun表达,导致PDK1显著下调,然而P13K抑制剂处理的细胞,PDK1表达无明显变化。这表明MAPK信号通路参与LTF抑制PDK1过程。随后,我们在LTF基因沉默细胞中转染c-Jun siRNA证实了抑制c-Jun表达确实能下调PDK1表达。这些结果表明,LTF能通过抑制MAPK活性下调PDK1的表达。AKT是PDK1最经典的靶分子,因此我们检测LTF对AKT通路的影响。我们发现过表LTF明显抑制AKT通路激活,而封闭LTF表达则促进AKT通路激活。AKT的充分活化需要PDK1磷酸化其Thr308和mTORC2磷酸化其Ser473。PDK1只负责磷酸化AKT蛋白的Thr308,与Ser473的磷酸化无关。我们意外地发现,AKT Ser473磷酸化被LTF下调的程度相似于甚至高于LTF下调Thr308磷酸化的程度。更重要的是,无论是野生型PDK1还是PDK1活性形式(PDK1-A280V)都能拯救LTF对AKT Thr308磷酸化的影响,但是两者都不能拯救其Ser473的磷酸化(图1-18)。这些结果表明,LTF能通过下调PDK1而抑制AKT活性,并且也提示,LTF还能通过其他的机制抑制AKT活性。2.LTF通过与Keratin18相互作用阻止Keratin18与14-3-3蛋白结合,进而阻止Keratin18促进AKT通路的激活为探讨LTF抑制AKT活性的新机制,我们寻找新的LTF交互作用蛋白。通过免疫共沉淀结合质谱分析,我们鉴定出3个LTF相互作用蛋白,分别是Keratin18(K18)、Keratin16(K16)、Keratin10(K10)。随后,通过免疫共沉淀-Western blot证实LTF与K18存在交互作用。并通过免疫荧光检测发现,LTF与K18在细胞浆内存在共定位现象。K18是细胞骨架中间丝蛋白中的角蛋白(Keratin)家族成员,新近研究显示,Keratin家族成员K17能以磷酸化依赖形式与adaptor蛋白14-3-3σ蛋白结合,K17与其结合后能作为一个支架蛋白募集信号蛋白激活AKT并且促进上皮细胞的生长。以往的研究显示Ser33磷酸化的K18也能与14-3-3蛋白,并且K18与14-3-3蛋白与有丝分裂期14-3-3蛋白在细胞内的重新分布有关。本研究我们也证实了K18能以磷酸化依赖形式与14-3-3σ相互作用,与K18结合是14-3-3蛋白滞留在胞浆内所必需的。并且我们也发现,K18能像其家族成员K17一样通过将14-3-3蛋白滞留在胞浆内而激活AKT通路,从而促进鼻咽癌细胞生长增殖。另外,抑制K18表达不影响MAPK通路和PDK1的表达,提示LTF抑制MAPK活性及下调PDK1表达与K18无关。为了明确LTF是否可通过与K18交互作用影响K18与14-3-3蛋白结合从而影响AKT通路激活,我们在过表达LTF的鼻咽癌细胞系中检测K18与14-3-3蛋白的结合。结果显示,LTF过表达在不影响K18磷酸化情况下阻止K18与14-3-3结合。通过免疫荧光发现过表达LTF能隔离14-3-3蛋白于胞核内。随后我们发现,LTF过表达能阻止K18促进AKT通路的激活及解除K18促进鼻咽癌细胞生长作用。3.LTF可通过AKT通路抑制鼻咽癌细胞生长转移LTF能通过两种不同的机制抑制P13K/AKT通路活性。为了确定LTF抑制鼻咽癌细胞生长转移的功能是否通过AKT通路途径实现,我们使用P13K/AKT特异性抑制剂处理LTF基因沉默的鼻咽癌细胞发现,与未处理的LTF基因沉默细胞相比,P13K/AKT特异性抑制剂处理的LTF基因沉默细胞生长速度减慢,软琼脂集落形成率减少,细胞侵袭能力下降。这些结果表明LTF确实可通过抑制AKT通路影响鼻咽癌细胞生长转移。采用组织芯片通过免疫组化检测鼻咽癌组织中LTF与AKT磷酸化表达情况。结果显示：与正常鼻咽上皮组织相比,LTF在鼻咽癌组织中表达明显下调；而AKT的磷酸化表达的则与之相反,与正常鼻咽组织相比,pAKT Thr308及pAKT Ser473在鼻咽癌组织中表达明显上调。在鼻咽癌中LTF与pAKT Thr308和pAKT Ser473呈负相关。并且,pAKT Thr308与pAKT Ser473呈正相关。这进一步支持LTF负调控AKT通路。4.miR-214通过靶向抑制LTF影响AKT通路,从而促进鼻咽癌细胞增殖侵袭能力前期研究中我室多次大样本量证实,LTF在鼻咽癌中显著下调或缺失。为确定LTF在鼻咽癌中下调是否与miRNA异常有关,我们研究LTF与miRNA关系。通过在线软件Targetscan预测及荧光素酶活性检测发现,miR-214能特异地与LTF3’UTR结合。并且miR-214能抑制LTF mRNA及蛋白表达。这说明miR-214直接靶向调控LTF。体内外研究显示,miR-214具有促进鼻咽癌生长转移的作用。因LTF能抑制AKT活性,所以我们检测miR-214对AKT通路的影响。结果显示,miR-214能促进AKT激活,并且过表达LTF能拮抗miR-214激活AKT,表明miR-214通过靶向抑制LTF影响AKT通路。接下来我们也通过细胞生长曲线和细胞侵袭实验证实,miR-214通过靶向抑制LTF,影响AKT通路,促进鼻咽癌细胞增殖侵袭能力。5.鼻咽癌中LTF低表达与miR-214高表达相关我们运用qRT-PCR在临床标本中检测miR-214与LTF表达情况。结果显示,与正常鼻咽上皮组织相比,miR-214在鼻咽癌组织表达普遍上调,并且在有转移的鼻咽癌组织明显高于无淋巴结转移的鼻咽癌组织。而LTF在组织中的表达模式与miR-214正好相反,与正常鼻咽上皮组织相比,LTF在鼻咽癌组织表达明显下调,并且在有转移的鼻咽癌组织明显低于无淋巴结转移的鼻咽癌组织。通过相关性分析发现鼻咽癌组织中LTF低表达与miR-214高表达相关。综上所述,LTF能通过两种不同机制抑制AKT通路激活：一是LTF通过抑制MAPK通路下调转录因子c-Jun,而c-Jun是PDK1转录激活因子,c-Jun下调导致PDK1表达下调,最终导致AKT活性下调；二是LTF通过与K18相互作用阻止K18与14-3-3蛋白结合,使14-3-3聚积于细胞核内,导致AKT活性下调。而LTF可通过抑制AKT通路发挥其抑制鼻咽癌生长转移作用。我们通过研究LTF与miRNA关系发现,鼻咽癌中LTF的表达受到miR-214的调控,miR-214通过靶向LTF影响AKT通路,从而促进鼻咽癌细胞生长侵袭能力。鼻咽癌组织中miR-214高表达是导致LTF低表达的机制之一。