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研究背景:精子变形是精子发生的关键环节,主要是指从圆型精子发育成为长型精子的过程,其异常会导致精子畸形或精子功能障碍,进而诱发不育。因此,阐明精子变形的精细机制对于雄(男)性不育研究具有重要意义。目前,对精子发生早期阶段的研究比较深入,但对精子变形过程的研究相对比较匮乏。本研究以我们课题组前期筛选到的一个精子特异性表达的钙离子结合蛋白Cabs1(Calcium binding protein,spermatid specific 1)及其反义 lncRNA(long noncoding RNAs),AntiCabs 1为对象,通过构建基因敲除小鼠及体外细胞过表达模型研究AntiCabs 1与Cabs1之间的相互调控作用,进一步探究它们在精子变形与精子功能调控中的作用及机制。研究方法:繁殖鉴定基因敲除小鼠、统计雄雌鼠生育前合笼天数和每窝仔数、观察雄性生殖组织器官形态变化以及成熟精子运动参数及形态,判断敲除小鼠雄性生育生殖能力是否受影响。就Cabs1敲除小鼠成熟精子畸形这一表型,探究精子发生及成熟过程的组织、精子发育正常与否。在体外过表达细胞、基因敲除小鼠模型中探究AntiCabs1分子过表达或缺失对Cabs1表达水平的影响。通过蛋白质谱鉴定技术,对附睾和精子中与Cabs1互作的蛋白分子进行分析筛选,同时筛选与Cabs1有相似敲除表型的分子,通过WB与IP验证,分析可能导致Cabs1 KO小鼠精子鞭毛结构畸形且在附睾穿行过程中发生折尾的分子机制。研究结果:1.本研究确定AntiCabs1与Cabs1基因敲除小鼠模型构建成功。2.对敲除小鼠生育能力及雄性生殖相关表型进行观测,发现AntiCabs1系雄鼠生育能力及各项生殖参数表现正常,而Cabs1系雄鼠生育能力受损,附睾尾处成熟精子活力降低且形态异常。3.Cabs1 KO小鼠精子发生过程完整,睾丸内部长型精子形态正常,而精子从睾丸中进入附睾,在附睾头、中、尾穿行的过程中,精子折尾比率逐渐增大,且畸形精子形态由半折尾形态(<180°)向发卡式折尾形态(180°)转变。为排除体外精子培养液导致精子折尾,我们制备和附睾环境类似的高渗透压溶液即430mOsm的HS(Hepes-bufferedsa1ine)溶液游离附睾精子,后将悬浮了精子的溶液渗透压调节到310mOsm。我们发现精子的折尾比率并未因渗透压改变出现大幅度改变,说明Cabs1缺失确实导致了精子在附睾穿行中发生畸形。此外,敲除小鼠中近一半精子的鞭毛中段与主段之间的结构(即Jenson ring)变细,附睾头部该处存在缺陷的精子比率与附睾尾部总的精子畸形率基本持平。4.质谱鉴定了大量与Cabs1互作的蛋白分子,其中很多互作蛋白与精子发生及细胞骨架形成有关。在生物信息学和文献检索分析筛选基础上,我们进一步对Cabs1的可能互作分子进行了验证,发现部分互作蛋白在KO和WT小鼠中的表达存在显著差异。5.AntiCabs1高表达并不影响Cabs1稳转H293细胞系中Cabs1的蛋白表达量。相比于WT雄鼠,AntiCabs1敲除鼠的Cabs1的表达量并没有明显地升高或降低。结论:Cabs1在表达水平上不受其反义lncRNA,AntiCabs1的调控。AntiCabs1敲除后雄性小鼠没有明显的生殖表型,但Cabs1对于精子变形至关重要,其缺失会引起精子畸形、精子活力下降,进而导致生育受损,主要原因可能是Cabs1缺失后与精子变形相关的Cabs1互作蛋白的功能失调。