目的:以“肾脑相济”理论为指导,观察电针疗法对围绝经期抑郁症大鼠行为学改变、大鼠海马CA3区尼氏小体活性的影响及海马CA3区神经干细胞绝对数量及神经干细胞分化情况,探索以Wnt通路为主要细胞信号通路的关键蛋白含量与海马干细胞增殖及分化的关系,寻求电针疗法对围绝经期抑郁症的作用机制,为针灸临床治疗本病提供理论依据。材料与方法:1.动物及分组选用SPF级雌性SD大鼠,所有动物进入实验室后进行3w适应性饲养。实验过程中对动物的处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。用随机数字表法将60只大鼠随机分为5组:空白组、假手术组、模型组、西药组、电针组每组12只。2.造模方法选择去势(OVX)联合慢性不可预见性刺激(CUMS)复制围绝经期抑郁症大鼠模型。造模大鼠先经水合氯醛腹腔注射麻醉,行双侧卵巢切除术。之后进行抑郁症模型复制,采用改良P.Willner传统慢性不可预见性刺激造模方法进行抑郁症模型复制。此复合造模方法已在国际有应用先例,是国际公认的造模方法。3.干预方法空白组大鼠正常饲养,不接受刺激。模型组及假手术组大鼠进行抓取并用布袋包覆固定20min。西药组大鼠使用盐酸氯米帕明片,将药片用研钵研碎后溶于0.9%生理盐水,按20mg/kg·d-1用量灌胃,连续28d。电针组大鼠用布袋包覆大鼠固定并针刺后加电针,针刺穴位定位参照《实验针灸学》,针刺双侧“肾俞”(位于大鼠背部,第二腰椎下旁开5mm之两旁肋间,直刺6mm),双侧“三阴交”(后肢内踝尖直上10mm,直刺5mm),头顶“百会”(顶骨正中,平刺2mm);两对电极接大鼠同侧三阴交及肾俞,第三对电极负极接百会,正极接鼠尾,电极(负载250Ω)0~18V,疏密波型,疏波4Hz,密波20Hz,强度以局部皮肤肌肉轻微颤动为度,留针20min,每日1次,连续28d。4.指标检测及方法分别在造模前、造模后、治疗后3个时间点进行行为学检测,包括旷场实验、强迫游泳实验、糖水实验;在尼氏染色条件下观察海马CA3区尼氏小体形态结构变化,测定尼氏小体总面积、积分光密度及平均黑度;免疫组化方法测定海马CA3区巢蛋白(Nestin)、星形胶质细胞特异性胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、微管蛋白(Tuj-1)标记的阳性细胞所占百分率;ELISA方法检测海马区糖原合成激酶(GSK-3β)及β-catenin含量,Western blots方法检测海马区β-catenin及P-β-catenin含量,RT-PCR方法检测GSK-3βmRNA及β-catenin mRNA含量。结果:1.行为学检测1.1旷场试验结果显示:造模前各组180 s中央格停留时间和运动距离与空白组比较P>0.05均没有统计学意义;造模后模型组、假手术组、西药组、电针组与空白组比较P<0.05有统计学意义。治疗后模型组与空白组比较P<0.05,西药组与模型组相比P<0.05,电针组与模型组比较P<0.05,西药组、电针组与假手术组比较,P<0.05有统计学意义,电针治疗后大鼠180 s中央格停留时间和运动距离都有所增加,同西药组结果相似。1.2糖水实验结果显示:造模前各组大鼠糖水偏嗜率与空白组比较比较P>0.05均没有统计学意义;造模后模型组、假手术组、西药组、电针组与空白组比较P<0.05有统计学意义。治疗后模型组与空白组比较P<0.05,西药组与模型组比较P<0.05,电针组与模型组比较P<0.05有统计学意义,西药组、电针组与假手术组比较,P<0.05有统计学意义,电针治疗后大鼠糖水偏嗜率有所增加,西药组结果相似。1.3强迫游泳实验结果显示:造模前各组强迫游泳180 s不动时间与空白组比较比较P>0.05均没有统计学意义;造模后模型组、假手术组、西药组、电针组与空白组比较P<0.05有统计学意义。治疗后模型组与空白组比较P<0.05,西药组与模型组比较P<0.05,电针组与模型组比较P<0.05有统计学意义,西药组、电针组与假手术组比较,P<0.05有统计学意义,电针治疗后大鼠强迫游泳180 s不动时间有所减少,西药组结果相似。2.形态学指标观察及检测2.1海马CA3区尼氏染色:海马CA3区尼氏染色显示,正常组大鼠海马CA3区锥体细胞层细胞数量多、排列整齐。神经元胞质内含有丰富的尼氏体,呈紫蓝色,神经元结构完整,胞核及胞质染色均匀、清晰。模型组大鼠海马CA3区细胞数量少,细胞间隙增大,排列疏松不齐,甚至出现细胞层中断,神经元细胞质内尼氏体数量减少,神经元细胞核消失,细胞质萎缩、出现空洞,轴突树突结构不完整,甚至出现细胞结构消失。西药组、电针组和假手术组的情况介于两者之间。神经细胞内尼氏小体面积、积分光密度、平均黑度均显示治疗后模型组与空白组比较P<0.05,假手术组与空白组比较P<0.05,西药组与模型组比较P<0.05,电针组与模型组比较P<0.05有统计学意义,西药组、电针组与假手术组相比P<0.05有统计学意义,电针治疗后尼氏小体活性有所提高同西药组结果相似。2.2海马CA3区免疫组化巢蛋白(nestin)阳性细胞率:CA3区nestin阳性细胞占总细胞百分率,治疗后模型组与空白组比较P<0.01,西药组与模型组比较P<0.01,电针组与模型组比P<0.01有显著统计学意义,西药组、电针组与假手术组比较,P<0.01有显著统计学意义,电针治疗后netin阳性细胞数量有所提高同西药组结果相似。2.3海马CA3区免疫组化星形胶质细胞特异性胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞率:CA3区GFAP阳性细胞占总细胞百分率,治疗后模型组与空白组比较P<0.01,假手术组与空白组比较P<0.05,西药组与模型组相比P<0.01,电针组与模型组比较P<0.01有显著统计学意义,电针治疗后GFAP阳性细胞数量有所提高西药组结果相似。2.4海马CA3区免疫组化微管蛋白(Tuj-1)阳性细胞率:CA3区Tuj-1阳性细胞占总细胞百分率,治疗后模型组与空白组相比P<0.01,假手术组与空白组比较P<0.01,西药组与模型组相比P<0.01,电针组与模型组相比P<0.01有显著统计学意义,西药组与假手术组比较,P<0.05有统计学意义,电针治疗后Tuj-1阳性细胞数量有所提高同西药组结果相似。3.分子生物学指标检测3.1海马区ELISA及RT-PCR检测糖原合成激酶(GSK-3β),GSK-3βmRNA及β-catenin,β-catenin mRNA含量:ELISA结果显示治疗后模型组与空白组比较P<0.05,假手术组与空白组比较P<0.05,西药组、电针组与假手术组比较P<0.05有统计学意义,西药组与模型组比较P<0.05,电针组与模型组比较P<0.05有统计学意义,电针治疗后wnt信号通路关键蛋白同阳性对照组西药组结果相似;RT-PCR结果显示治疗后模型组与空白组比较P<0.05,西药组、电针组与假手术组比较,P<0.05有显著统计学意义,西药组与模型组比较P<0.05,电针组与模型组比较P<0.05有显著统计学意义,电针治疗后wnt信号通路关键蛋白同西药组结果相似。3.2海马区western blot检测β-catenin及p-β-catenin含量:结果显示β-catenin蛋白含量治疗后模型组与空白组比较P<0.01,西药组、电针组与假手术组比较,P<0.05有统计学意义,西药组与模型组比较P<0.05,电针组与模型组比较P<0.05有统计学意义;P-β-catenin含量治疗后模型组与空白组比较P<0.01,假手术组与空白组比较P<0.01,电针治疗后Wnt信号通路关键蛋白同西药组结果相似。结论:1.电针与氯米帕明干预均能有效改善模型大鼠行为学指标,说明电针对围绝经期抑郁症模型大鼠的治疗作用可以通过大鼠行为学变化予以体现。2.电针“百会”、“三阴交”及“肾俞”穴能够提高海马CA3区神经元细胞功能活性,为神经干细胞增殖及分化提供了形态学研究基础。3.电针“百会”、“三阴交”及“肾俞”穴能够增加围绝经期抑郁症模型大鼠海马CA3区神经干细胞绝对数量,促进神经干细胞向神经元细胞及星形胶质细胞分化。4.电针“百会”、“三阴交”及“肾俞”穴对围绝经期抑郁症模型大鼠的改善作用可能与电针疗法对海马神经干细胞的良性调整作用有关,且激活Wnt信号通路是其关键。5.本研究认为,围绝经期抑郁症大鼠肾虚为本,以“补肾益脑,安神解郁”为治则的电针疗法对围绝经期抑郁症的干预作用体现在对肾精封藏作用的激活方面:一是促进海马神经干细胞活力及再生,二是调控海马神经干细胞分化。