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第一部分:Wnt/JNK信号激活对心肌重构的影响目的:探讨Wnt/JNK信号激活对心肌细胞重构的影响。方法:采用体外培养原代新生鼠心肌细胞模型,于培养1天后给予Wnt5a或者JNK抑制剂(sp600125)刺激。分为正常对照组(NC组),Wnt5a组,sp600125组,Wnt5a+sp600125组。分别采用荧光染色方法检测心肌细胞大小,激光共聚焦检测心肌细胞骨架形态,JC-1检测线粒体膜电位,Ca-AM检测线粒体膜通透性,Hoechest染色联合流式细胞仪检查凋亡水平。Western Blotting 检测 c-Jun,ANF,β-MHC,Bcl-2,Bax,c-caspase-9-3,cyc,VDAC,CyPD,ANT 蛋白的表达。结果:①随Wnt5a处理时间延长,心肌细胞JNK活性逐渐增加,在第5小时变化最显著(P<0.01)。②与NC组相比,Wnt5a组心肌细胞表面积大小显著增加(P<0.05);与Wnt5a组相比,Wnt5a+sp600125组心肌细胞表面积大小则显著减小(P<0.05)。③与NC组相比,Wnt5a组肥大因子ANF蛋白表达水平显著增加(P<0.05);与Wnt5a组相比,Wnt5a+sp600125组ANF蛋白表达显著降低(P<0.05)。④与NC组相比,Wnt5a组骨架结构紊乱的心肌细胞百分比增多(P<0.05);与Wnt5a组相比,Wnt5a+sp600125组骨架结构紊乱的心肌细胞百分比降低(P<0.05)。⑤与NC组相比,Wnt5a组凋亡细胞核百分比,细胞凋亡百分比,凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2,c-caspase-9-3,Cyc表达均显著升高(P<0.05);与Wnt5a组相比,Wnt5a+sp600125组凋亡细胞核百分比,细胞凋亡百分比,凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2,c-caspase-9-3,Cyc表达均显著降低(P<0.05)。⑥与NC组相比,Wnt5a组线粒体膜电位显著降低,线粒体膜通透性显著增高,线粒体VDAC蛋白表达显著降低(P<0.05);与Wnt5a组相比,Wnt5a+sp600125组线粒体膜电位显著升高,线粒体膜通透性显著降低,线粒体VDAC蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论:Wnt5a通过激活Wnt/JNK通路促进心肌细胞重构。第二部分:Wnt/JNK激活导致心肌重构的机制研究目的:探讨Wnt/JNK信号通路激活导致心肌重构的相关机制。方法:采用体外培养原代新生鼠心肌细胞模型,通过siRNA转染技术低表达心肌细胞Vang12蛋白并给予Wnt5a刺激。分为空载体转染组(scramble-siRNA),空载体转染组+Wnt5a(scramble-siRNA+Wnt5a),Vang12 低表达组(Vang12-siRNA),Vang12 低表达+Vang12-siRNA 组(Vang12-siRNA+Wnt5a)。分别采用荧光染色方法检测心肌细胞大小,激光共聚焦检测心肌细胞骨架形态,JC-1检测线粒体膜电位,Ca-AM检测线粒体膜通透性,Hoechest染色联合流式细胞仪检查凋亡水平。Western Blotting 检测 Vang12,c-Jun,ANF,JNK,Bcl-2,Bax,c-caspase-9-3,cyc,VDAC 蛋白的表达。结果:①Vangl2-siRNA导致心肌细胞Vangl2蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。②与 scramble-siRNA 组相比,scramble-siRNA+Wnt5a 组心肌细胞表面积大小显著增加(P<0.05);与scramble-siRNA+Wnt5a组相比,Vangl2-siRNA+Wnt5a组心肌细胞表面积大小显著减小(P<0.05)。③与 scramble-siRNA 组相比,scramble-siRNA+Wnt5a 组肥大因子ANF以及c-jun蛋白表达水平显著增加(P<0.05);与scramble-siRNA+Wnt5a 组相比,Vangl2-siRNA+Wnt5a 组 ANF 以及 c-jun蛋白表达显著降低(P<0.05)。④与scramble-siRNA组相比,scramble-siRNA+Wnt5a组骨架结构紊乱的心肌细胞百分比增多(P<0.05);与 scramble-siRNA+Wnt5a 组相比,Vangl2-siRNA+Wnt5a组骨架结构紊乱的心肌细胞百分比降低。⑤与scramble-siRNA组相比,scramble-siRNA+Wnt5a组凋亡细胞核百分比,细胞凋亡百分比,凋亡相关蛋白 Bax/Bcl-2,c-caspase-9-3,Cyc 表达均显著升高(P<0.05);与 scramble-siRNA+Wnt5a 组相比,Vangl2-siRNA+Wnt5a 组凋亡细胞核百分比,细胞凋亡百分比,凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2,c-caspase-9-3,Cyc表达均显著降低(P<0.05)。⑥与scramble-siRNA组相比,scramble-siRNA+Wnt5a组线粒体膜电位显著降低,线粒体膜通透性显著增高,线粒体VDAC蛋白表达显著降低(P<0.05);与scramble-siRNA+Wnt5a 组相比,Vangl2-siRNA+Wnt5a 组线粒体膜电位显著升高,线粒体膜通透性显著降低,线粒体VDAC蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论:Wnt/JNK通路激活导致的心肌细胞重构与Vangl2有关。