【摘 要】
：
几丁质酶是一类可以催化由β-1,4糖苷键连接而成的几丁质并将其专一性降解为几丁寡糖、壳聚糖和N-乙酰葡萄糖胺的糖苷键水解酶。几丁质酶降解几丁质生成的产物几丁寡糖因具有良好的水溶性、抗氧化性和抗菌性能,广泛应用于化妆品、医药、食品和农业等领域。与传统的化学法降解几丁质相比,几丁质酶法生产几丁寡糖条件温和,对环境污染小,已成为几丁寡糖制备的发展方向。然而,野生菌产的几丁质酶催化效率低,仅有少数粘质沙雷
论文部分内容阅读
几丁质酶是一类可以催化由β-1,4糖苷键连接而成的几丁质并将其专一性降解为几丁寡糖、壳聚糖和N-乙酰葡萄糖胺的糖苷键水解酶。几丁质酶降解几丁质生成的产物几丁寡糖因具有良好的水溶性、抗氧化性和抗菌性能,广泛应用于化妆品、医药、食品和农业等领域。与传统的化学法降解几丁质相比,几丁质酶法生产几丁寡糖条件温和,对环境污染小,已成为几丁寡糖制备的发展方向。然而,野生菌产的几丁质酶催化效率低,仅有少数粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）、链霉菌（Streptomyces）和木霉（Trichoderma）等可以用于工业化生产,限制了其生产和应用。本研究以大肠杆菌BL21（DE3）作为表达宿主,以获得培养周期短、催化效率高的几丁质酶为目的,将来源于淀粉酶链霉菌CS1801（Streptomyces diastaticus CS1801）的几丁质酶 PROKKA01070 基因进行生物信息学分析,预测几丁质酶性质和结构,通过构建表达载体转化BL21（DE3）并诱导表达得到高活性重组几丁质酶,分析并确定几丁质酶结构中起催化作用的关键氨基酸残基。同时,探究几丁质酶的酶学性质,为几丁质酶工程菌应用于工业化生产提供理论基础。主要研究结果如下:（1）几丁质酶生物信息学分析。利用生物信息学数据库、软件分析几丁质酶的基因序列。通过理化性质分析,几丁质酶编码354个氨基酸,蛋白分子量为38 kDa,理论等电点pI为4.24,稳定性指标判定该酶为稳定性蛋白,亲水性平均值为-0.363,判定为亲水性蛋白;通过跨膜域和信号肽分析发现几丁质酶不行使跨膜功能,无信号肽存在;二级和三级结构预测表明几丁质酶二级结构由21.75%helix、67.23%loop和11.02%strand组成,三级结构由α-螺旋内桶和β-折叠外桶组成;几丁质酶催化域氨基酸序列比对发现,几丁质酶在催化结构域中存在典型的18家族保守区“DxxDxDxE”和“SxGG”结构,判断该几丁质酶属于18家族糖苷水解酶。（2）淀粉酶链霉菌CS1801几丁质酶的克隆表达。通过对几丁质酶PROKKA01070基因进行PCR扩增和TA克隆,获得大小约为1065 bp几丁质酶DNA片段和克隆载体ChiA/pMD19-T;通过构建表达载体和原核表达,获得重组质粒ChiA/pET-32a（+）和重组工程菌ChiA/pET-32a（+）/BL21（DE3）;对重组工程菌ChiA/pET-32a（+）/BL21（DE3）诱导表达、SDS-PAGE分析和酶活性测定,获得大小为38 kDa可溶性几丁质酶,酶活为0.132 U·mL-1,比原始酶活（0.1U·mL-1）提高32%;将预测的几丁质酶催化域活性氨基酸进行定点突变,确定了几丁质酶催化活性的氨基酸残基位点为D128、D130和E132。（3）重组几丁质酶酶学性质的研究。重组几丁质酶的最佳反应温度为50℃,最佳反应pH为7.0;对重组几丁质酶热稳定性和pH稳定性研究发现重组几丁质酶在25℃和pH为5.0的缓冲液中最为稳定;金属离子和化学试剂对重组酶活性有影响,Zn2+、SDS在三种浓度下,对该酶均有强烈的抑制作用,Na+和Li+在任何浓度下对该酶均有促进作用,Fe3+、Mg2+和Ca2+在1 mM浓度下,对该重组酶有促进作用;重组几丁质酶底物特异性研究发现,重组几丁质酶对胶体几丁质分解能力最强为100%,对分解粉末几丁质、虾壳粉、蟹壳粉的能力很弱,分别为9.8%、6.5%、5.8%,不能分解壳聚糖和羧甲基纤维素钠;以胶体几丁质为底物时Km为0.281mg·mL-1,Vmax 为 0.536μM·mL-1·min-1,催化效率为 21.2 mL·s-1·mg-1。
其他文献
目的:探讨影响腹膜透析（PD）患者发生导管感染的危险因素并建立列线图预测模型。方法:收集于本院行PD的213例慢性肾衰竭患者资料，将患者按6∶4分为建模组（128例）及验证组（85例）。建模组患者根据是否发生导管感染分为导管感染组和无导管感染组，并行单因素及多因素Logistic回归分析，建立列线图预测模型并绘制校准曲线及ROC曲线评估模型的有效性及区分度。结果:导管感染组和无导管感染组患者的体质
人们在室内环境的时间超过80%,室内环境的质量会对人的健康、居住舒适度等造成影响。LED人工天窗作为一种新兴的照明方式,在解决正常室内采光的基础上,增加了人本照明的设计理念。由于LED人工天窗对于提升室内采光和改善人们情绪等方面具有显著效果,逐渐被大众所熟知。蓝天效果的实现主要有散射板、液晶屏和画布三种方案。散射板可以真实地复现蓝天,但是研制成本高、难度大,未被广泛应用。液晶屏和画布方案,虽有结构
由于光伏组件长期暴露在室外工作,易受到树叶、鸟粪、灰尘等长期落在光伏上,容易形成热斑,它直接减低了输出效率,严重时可烧毁光伏板。目前,热斑的巡检还处于人工巡检的阶段,效率低、误差大或者无人机巡检不能同步视频处理。针对以上实际光伏电站存在的问题,论文主要工作包括以下几点:（1）根据太阳能光伏组件工作特性,提出一种基于无人机红外视频的光伏组件热斑缺陷检测与定位的检测方法,根据设计方案对无人机进行选型和
“十三五”规划实施以来,国家治理体系和治理能力得到很大发展,我国产业迈向中高端水平,经济逐渐转向高质量发展,核心是对人力资源的开发利用,高技能人才的质量和数量成为关键因素。经济转型对整个社会而言,既是挑战也是机遇。曾经的劳动密集型人口红利逐渐消失,高新技术战略、新型工业化成为主导,企业更新改造工艺技术装备,需要大量具备专业技术的高技能人才作为基础支撑。高技能人才是产业升级、推动企业工艺技术革新、科
随着蒸汽管网在集中供热领域的广泛应用,对蒸汽管网进行合理的优化设计能够有效提高能源的利用率,对推动集中供热事业发展具有重大意义。本文分析蒸汽管道的散热计算模型,探讨影响蒸汽管道散热损失的主要因素,提出了一种结合智能算法的蒸汽管网优化设计方法,其内容包含能源站选址、管径优化、保温层优化三个方面。基于MATLAB＿GUI技术开发了一款蒸汽管网优化设计软件。主要研究内容如下:根据蒸汽管网与外界环境的换热
自改革开放以来,我国经济社会面貌出现巨大转变,生产力水平和城市化水平飞速提升,城乡一体化成为社会发展的必经之路。它要求统一城乡规划、打破城乡分割,将农民与土地分离,通过土地征用、拆迁安置等措施将农民转移出来,大量失地失宅农民居住于政府安置房,形成了集聚的拆迁安置小区,不可避免地产生了多种问题和矛盾。本文选取城乡一体化背景下拆迁安置小区火灾隐患治理对策的角度来开展研究。本文通过文献法、个案分析法、对
近二十年来,我国城市化的发展水平不断提高、步伐加速,城市不断扩展并覆盖周边的农村地区,规模化动迁运动顺势而生。各地农村宅基地房屋的拆除和农村土地的重新规划流转,一方面给经济的发展奠定了十分重要的空间基础,且成为当地政府最直接的土地经济收入来源;另一方面在这种新型城镇化战略下,原先以土地为生存基础的农民,通过政府的动迁补偿安置政策,退出土地经营权,搬至居民楼居住,成为了“村转居”的失地农民。这类数量
“无讼”,即消弭诉讼,最早由孔子提出。近年来,随着经济社会飞速发展,社会矛盾纠纷呈爆炸式增长,因各类矛盾纠纷引发的极端案件也时有发生,矛盾纠纷化解工作面临很大挑战,很多地区都开展了“无讼村居”建设,旨在营造出“少讼、止讼乃至无讼”的社会环境,当然“无讼”是对社会和谐社会关系的终极追求,具体方式则是通过社会矛盾纠纷化解工作的不断优化提升。本文从社会治理的角度,以S市N区“无讼村居”建设情况为案例,以
随着当前我国经济结构不断地优化和调整,供给侧改革深入推动,我国的制造业已从产业链中的低端向高层次发展。在做大的基础上逐步向做强迈进,这对培养能够适应先进制造业工作要求的新型高技能人才提出了更高的要求。职业院校作为制造业人才重要的输出源,必须对人才的培养目标、方式和要求进行重构,以适应先进制造业等领域对高素质技能人才的需求。长期以来,中职教育的发展与我国制造业发展紧密相连,为制造业输送了大量的技术和
当前,我国正处于全面建成小康社会的决定性阶段,全面建成小康社会的关键在于农村。而农村地区赌博现象较为普遍,赌博人群趋向年轻化,赌博方式从传统方式演变为流动型、新型赌博,从小规模向有组织甚至涉黑涉恶犯罪演变,因赌博造成倾家荡产、父子反目、夫妻分离等情况屡见不鲜,成为影响农民家庭生活和农村社会稳定的重要因素,农村赌博的盛行也有悖于乡村振兴和全面建成小康社会的要求。破除农村赌博陋习,构筑起乡风文明新时尚