羽扇豆醇在急性髓系白血病中的作用及机制研究

来源 :河南中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hnlqlql
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第一部分羽扇豆醇对AML细胞生长抑制作用及分子机制目的:探讨羽扇豆醇对急性髓系白血病细胞株THP-1、KG-1a、HL-60细胞株增殖的影响及分子机制。方法:(1)CCK-8法检测不同浓度羽扇豆醇对急性髓系白血病细胞株THP-1、KG-1a、HL-60细胞生长的抑制作用。(2)倒置显微镜观察不同浓度羽扇豆醇作用急性髓系白血病细胞株THP-1 48小时后细胞数量变化。(3)瑞氏染色观察不同浓度羽扇豆醇作用急性髓系白血病细胞株THP-1 48小时后细胞形态学变化。(4)流式细胞术检测不同浓度羽扇豆醇作用急性髓系白血病细胞株THP-1 48小时后细胞凋亡及周期变化。(5)Western Blot检测细胞凋亡和细胞周期中相关蛋白的变化:不同浓度羽扇豆醇作用THP-1细胞48小时后,Western Blot检测凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9、PARP的变化和周期蛋白CyclinD1、CDK4、P21的变化。结果:(1)羽扇豆醇抑制AML细胞株THP-1细胞的生长。分别采用0、10、20、40、80、160μmol/L的羽扇豆醇作用AML细胞株KG-1a、HL-60和THP-1细胞24、48、72小时后,CCK-8结果显示:羽扇豆醇对KG-1a细胞与HL-60细胞无明显的生长抑制作用,但对THP-1细胞有明显的生长抑制作用,THP-1细胞的存活率随着药物浓度的增加而降低,且呈剂量和时间依赖性抑制THP-1细胞生长。又采用0、20、40、60、80、100、120、140μmol/L的羽扇豆醇作用于THP-1细胞24、48、72小时后,24h的IC50为:154.5μmol/L,48h 的 IC50 为:78.18μmol/L,72h 的 IC50 为:49.02μmol/L。(2)羽扇豆醇抑制AML细胞株THP-1细胞的生长。采用0、50、80、100μmol/L羽扇豆醇作用48小时后,在倒置显微镜下观察对照组(0μmol/L羽扇豆醇)THP-1细胞呈悬浮生长,圆形,大小均匀,形态一致,透光性好,背景清亮,细胞数量较多,密度大。不同浓度羽扇豆醇作用THP-1细胞48h后,可以明显观察到随着羽扇豆醇浓度的升高,THP-1细胞数量减少,细胞密度明显下降,轮廓模糊,随着药物浓度的增加,密度下降的越明显。(3)羽扇豆醇诱导AML细胞株THP-1细胞凋亡形态的变化。采用0、50、80、100μmol/L羽扇豆醇作用THP-1细胞48小时后,瑞氏染色观察细胞形态学变化:0μmol/L的THP-1细胞在瑞氏染色下呈圆形,胞浆丰富,核膜清晰可见,大小均匀一致。50、80、100μmol/L的羽扇豆醇作用THP-1细胞,细胞形态发生了明显的改变:细胞碎片增多,大小不一致,胞膜破损,核碎裂,呈大小不等、形态不规则的碎片,这是典型的凋亡细胞形态,随着浓度的增加细胞形态改变的越明显。(4)羽扇豆醇诱导AML细胞株THP-1细胞凋亡。①采用0、50、80、100μmol/L羽扇豆醇作用THP-1细胞48小时后,流式细胞术检测THP-1细胞凋亡率分别为10.76 ±0.47%、17.21±0.94%和 38.63±4.28%,与对照组(0μmol/L)凋亡率 2.26±0.57%比较,差异有统计学意义(P<0.01)。②采用0、50、80、100μmol/L的羽扇豆醇处理THP-1细胞48小时,Western Blot检测凋亡蛋白的变化,结果显示Caspase-3、Caspase-9和PARP出现了剪切激活带,并且随着羽扇豆醇浓度的增加而增加。(5)羽扇豆醇诱导AML细胞株THP-1细胞G1期阻滞。①采用0、50、80、100μmol/L的羽扇豆醇处理THP-1细胞48h后,流式细胞术检测出结果显示:50、80、100μmol/L的羽扇豆醇处理THP-1细胞处于G1期细胞比例分别为:50.10±3.82%、58.94±2.30%、65.26±2.53%,与对照组(0μmol/L)G1期比例42.08±2.90%相比,差异有统计学意义(P<0.05)。②采用0、50、80、100μmol/L的羽扇豆醇处理THP-1细胞48小时,Western Blot检测周期蛋白的变化,结果显示Cyclin D1、CDK4蛋白均明显下调,而P21蛋白则明显上调。结论:(1)羽扇豆醇对THP-1细胞有生长抑制作用,对KG-1a和HL-60细胞无明显生长抑制作用。(2)羽扇豆醇通过Caspase-3、Caspase-9、PARP剪切激活来诱导THP-1细胞凋亡。(3)羽扇豆醇通过下调CyclinD1、CDK4蛋白,上调P21蛋白使THP-1细胞阻滞于G1期。第二部分羽扇豆醇对THP-1细胞的PI3K110/AKT信号通路的影响目的:探讨羽扇豆醇对THP-1细胞PI3K110/AKT信号通路的影响。方法:羽扇豆醇作用THP-1细胞48小时后,Western Blot法检测PI3K110/AKT信号通路蛋白的变化。结果:用0、50、80、100μmol/L的羽扇豆醇处理THP-1细胞48小时,细胞裂解、蛋白定量后采用Western Blot检测PI3K/AKT信号通路蛋白的变化,结果显示PI3K110和P-AKT蛋白表达下调,而AKT蛋白表达无明显变化。结论:羽扇豆醇能够抑制THP-1细胞的PI3K110/AKT信号通路。
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